Способ обнаружения антирабических антител с помощью прямого “сэндвич” – варианта твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ-ИФА) на основе антиидиотипических иммуноглобулинов

(51) 61 39/205 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, биотехнологии и иммунологии, а именно, касается способа обнаружения антирабических антител с помощью прямого сэндвич- варианта твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ-ИФА) на основе антиидиотипических иммуноглобулинов. Сущность изобретения включает антиидиотипические антитела,имитирующие внутренний образ антигенов вируса бешенства и способные имитировать его в диагностических реакциях, а также способ предполагающий сенсибилизацию полистироловых планшет антиидиотипическими иммуноглобулинами внесением исследуемых и контрольных сывороток и детекцию наличия антирабических антител в исследуемых сыворотках при помощи пероксидазного конъюгата антиидиотипических иммуноглобулинов и субстратно-индикаторного раствора.(72) Жилин Евгений Сергеевич Кошеметов Жумагали Каукарбаевич Татыбаева Айнура Тлеукановна Матвеева Валентина Михайловна Алиева Алина Бейсеновна Мыктыбаева Гаухар Базарлыевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ С ПОМОЩЬЮ ПРЯМОГО СЭНДВИЧ ВАРИАНТА ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА (ТФИФА) НА ОСНОВЕ АНТИИДИОТИПИЧЕСКИХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ Область техники Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии,биотехнологии и иммунологии, а именно, касается способа обнаружения антирабических антител с помощью прямого сэндвичварианта твердофазного иммуноферментного анализа (ТФИФА) на основе антиидиотипических иммуноглобулинов. Антиидиотипические антитела, антиидиотипы(- , -) - антитела,специфические по отношению к антигенным детерминантам, расположенным на вариабельных участках других антител. Иными словами,антиидиотипические антитела комплементарны определенной конфигурации пептидной цепи в составе другого антитела, в свою очередь комплементарной и конфигурации антигена. Тем самым антиидиотипические антитела химически воспроизводят нужную конфигурацию антигена и могут рассматриваться как имитатор или аналог антигена. Сущность изобретения включает антиидиотипические антитела,имитирующие внутренний образ антигенов вируса бешенства и способные имитировать его в диагностических реакциях, а также способ предполагающий сенсибилизацию полистироловых планшет антиидиотипическими иммуноглобулинами внесением исследуемых и контрольных сывороток и детекцию наличия антирабических антител в исследуемых сыворотках при помощи пероксидазного конъюгата антиидиотипических иммуноглобулинов и субстратно-индикаторного раствора. В настоящее время уровень активности антирабических сывороток определяютв реакции нейтрализации (РН) вируса бешенства на белых мышах по Е. .(Методы лабораторных исследований по бешенству, ВОЗ,1996). Данный метод основан на нейтрализации постоянной дозы предварительно протитрованного инфицирующего вируса бешенства рядом последовательных разведений исследуемой сыворотки или иммуноглобулина. Метод складывается из следующих этапов приготовление и титрование инфицирующего вируса нейтрализация вируса сывороткой или иммуноглобулином (разведение сыворотки или иммуноглобулина и приготовление смеси сыворотка или иммуноглобулин - вирус инокуляция мышам) интерпретация результатов. Для определения 50 вируса мышам вводят интрацеребрально по 0,03 мл суспензии вируса каждое разведение вводят группе из 5 животных. Регистрируют число мышей,погибших в период между 6-м и 20-м днем после заражения. Расчет 50 вируса проводят по методу(Методы лабораторных исследований по бешенству, ВОЗ, 1996). Для нейтрализации используют суспензию мозга,содержащую от 100 до 1000 50/0,03 мл. Для этапа нейтрализации готовят ряд разведений испытываемой сыворотки по 0,5 мл каждого из этих разведений переносят в ряд пробирок. Затем в каждую пробирку добавляют 0,5 мл установленного разведения вируса. После инкубации в течение 1 ч при 37 С заражают интрацеребрально мышей, вводя им по 0,03 мл каждого разведения (по 5 мышей на каждое разведение). Регистрируют число мышей,погибших в период между 6-м и 20-м днем после заражения. Анализ результатов и расчет титра сыворотки проводят по методуи . Однако метод РН обладает рядом недостатков трудоемок, требует большого количества животных,длительного времени наблюдения (20 дней) и предполагает использование инфекционного агента. В связи с этим актуальной представляется разработка альтернативных методов определения специфической активности антирабических гипериммунных сывороток и иммуноглобулина. Комитет экспертов ВОЗ по бешенству в своих документах неоднократно подчеркивал необходимость разработки методов титрования антител(СТД ВОЗ 523, 709, 824, 931). Известен метод реакции непрямой гемагглютинации с применением сухого эритроцитарного диагностикума для титрования сывороток доноров при получении антирабического иммуноглобулина из крови человека (Шафеева Р.С,Шамсувалеева А.К., 1995). Сухой эритроцитарный диагностикум получали путем сенсибилизации формалинизированных гусиных эритроцитов концентрированным очищенным культуральным вирусом Внуково-32 в присутствии 0,1 раствора хлорного хрома. К недостаткам этого метода можно отнести использование для конструирования диагностикума нестабильных биологических компонентов и трудоемкость. Известно о применении реакции диффузионной преципитации(РДП),реакции связывания комплемента (РСК), ИФА для определения уровня специфических антител в сыворотках крупного рогатого скота, кроликов и лис (Сазанова Э.Я.,Кузнецова СВ., Маслов Е.В. и др., 1991). Недостатками РСК и РДП является их недостаточная чувствительность по сравнению с ИФА. Известно о применении теста ингибиции фокусов флюоресценции для определения вируснейтрализующих антител в сыворотках крови крупного рогатого скота, лошадей и собак,иммунизированных инактивированной культуральной антирабической вакциной(Недосеков В.В., Вишняков И.Ф., Жестерев В.И. и др., 1998). Предлагаемый метод дает 100 корреляцию с РН. Недостатками метода являются его трудоемкость, дороговизна, потребность в квалифицированных специалистах и специальном оборудовании для работы с перевиваемой культурой клеток почек сайги, использование токсичных реагентов для фиксации клеток, необходимость получения ФИТЦ-конъюгатов. Известен способ титрования вируснейтрализующих антител против бешенства в сыворотке крови вакцинированных животных заключающийся в том,что проводят взаимодействие вакцинного вируса бешенства 2 штамма 71 БелНИИЭВ-ВГНКИ с исследуемыми сыворотками, реакционную смесь вирус-сыворотка инкубируют 60 мин при 37 С, вносят суточную интактную культуру клеток почки сайги и помещают в СО 2 инкубатор с последующим определением на 5-7 суток титра вируснейтрализующих антител по предельному разведению сыворотки, при котором наблюдалось 50 подавление цитопатического действия вируса на культуру клеток. Недостатком этого метода является необходимость поддержания культуры клеток почек сайги, а также долговременность теста(патент 2254575). Среди новых, рекомендуемых МЭБ методовна культуре клеток, можно выделить тест ингибиции фокусов флюоресценции (и тест флюоресценции вируснейтрализующих антител , которые позволяют по определенному в тестируемых сыворотках количеству антирабических антител определять уровень протективного иммунитета. Постановка тестовтребует специально аккредитованной лаборатории, длительного времени(2-3 дня), необходимости поддержания культуры клеток, использования вирулентного вируса. Известно о применении иммуноферментного метода (ИФА) для обнаружения антител к вирусу бешенства в крови лисиц с использованием антивидовых реагентов(Кузьмин И.В.,Хисматуллина Н.А., Колесникова Е.М., 2001). Для конструирования диагностикума применяли пероксидазный конъюгат кроличьего иммуноглобулина. По данным авторов, не выявлено корреляции ИФА и реакции нейтрализации в 100 случаев, и в целом данный метод рекомендован как качественный для скрининговой оценки иммунного статуса популяций лисиц в природных очагах бешенства при проведении эпизоотологических и эпидемиологических обследований и на территориях проведения оральной вакцинации животных. Известно о применении ИФА для определения антител к гликопротеиду вируса бешенства в сыворотках вакцинированных людей с применением диагностикума, Франция (Сельникова О.П., Моисеева А.В., Антонова Л.А., Маричев И.Л., 2005). К преимуществам ИФА относится высокая чувствительность, возможность автоматизации,использование инактивированного вируса и возможность в короткие сроки(3-5 ч) количественно определять в сыворотках привитых против бешенства животных уровень антирабических антител, 2004). Недостатками используемых модификаций метода ИФА для выявления антител являются необходимость получения антивидовых реагентов для изготовления конъюгата, что учитывая широкий спектр видов вакцинируемых животных практически невыполнимо. Для исследования сыворотки каждого исследуемого вида вакцинированного животного необходим антивидовой конъюгат иммуноглобулина. Предлагаемое изобретение по сравнению с другими способами для выявления антирабических антител характеризуется существенными отличительными признаками,выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования. Преимуществом предлагаемого способа постановки ИФА является отсутствие необходимости использования препаратов антивидовых конъюгатов для выявления антирабических антител,используется один пероксидазный конъюгат антиидиотипического иммуноглобулина пригодный для детекции антител в сыворотках от любого вида животных. Замена вирусного антигена для сенсибилизации полистироловых планшет антиидиотипическими иммуноглобулинами (аналог, имитатор антигена) повышает безопасность диагностического теста. Кроме того использование в тест-системе антиидиотипических антител повышает чувствительность и специфичность теста. Проведенный заявителем анализ уровня техники,включающий поиск по патентным и научнотехническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемых изобретений, позволил установить,что заявитель не обнаружил источники,характеризующиеся признаками, тождественными(идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Поисковые исследования прототипа,как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволило установить отсутствие такового. Следовательно,заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности новизна. Для проверки соответствия предлагаемых решений условию патентоспособности изобретательский уровень проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительные части независимых пунктов формулы. Результаты поиска показали, что предлагаемые решения не вытекают для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности изобретательский уровень. Достижение технического результата от использования предлагаемого способа объясняется тем, детектируемые антирабические антитела в исследуемых сыворотках реагируют с антиидиотипическими антителами сорбированными на полистироле планшета имитаторами антигена) и выявляются при помощи пероксидазного конъюгата антиидиотипических иммуноглобулинов и субстратно-индикаторного раствора. Задача разработать способ детекции антирабических антител с помощью прямого сэндвичварианта твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ-ИФА) на основе антиидиотипических иммуноглобулинов. Решение поставленной задачи достигается следующим образом в лунках полистиролового плоскодонного планшета адсорбируют антиидиотипические антитела, специфичные к антирабическим антителам в рабочем разведении(КББ), рН 9,6. Адсорбцию проводят в течение 2 ч при (370,5)С или 18 ч при (42)С. Затем планшет четырехкратно промывают 0,01 М фосфатносолевым буфером (рН 7,2-7,4) с 0,05 -80(далее отмывочным буфером) для ИФА и блокируют свободные сайты связывания полистирола бычьим сывороточным альбумином(БСА). Для этого в лунках планшета инкубируют по 0,1 см 3 отмывочного буфера, содержащего 1 БСА в течение 1 ч при (370,5)С. Затем содержимое лунок удаляют, планшет четырехкратно промывают отмывочным буфером и подсушивают на фильтровальной бумаге путем лгкого постукивания(до использования планшет хранят при минус(153)С не более одной недели). Далее готовят разведения контрольных (специфического и нормального) и испытуемых сывороток (как указано в таблице 1) на отмывочном буфере и вносят по 0,1 см 3 в один ряд лунок планшета (по горизонтали). Примерная схема постановки прямого сэндвичварианта ТФ-ИФА при выявлении антирабических антител представлена в таблице 1. Таблица 1 Схема постановки прямого сэндвич- варианта ТФ-ИФА при детекции антирабических антител Примечания 1 СН/ССнормальная/специфическая сыворотка 2 положительный результат (синее окрашивание) 3 отрицательный результат (слабо-голубое окрашивание или окрашивания нет). Время контакта контрольных (специфического и нормального иммуноглобулина) и испытуемых сывороток с адсорбированным на полистироле антиидиотипическим иммуноглобулином составляет 2 ч при (370,5)С или 16 ч при(42)С. После чего планшет четырехкратно промывают отмывочным буфером, подсушивают,затем в каждую лунку планшета вносят по 0,1 см 3 иммунопероксидазного конъюгата антиидиотипического иммуноглобулина в рабочем разведении (1200). Планшет с конъюгатом инкубируют в течение 50 мин при(370,5)С, затем шестикратно промывают отмывочным буфером и вносят по 0,1 см 3 рабочего раствора субстрата с хромогеном для пероксидазы хрена. Результаты реакции учитывают через 15-30 мин визуально и автоматически. Разведения сывороток СС 400 При визуальном учете результатов реакции титром антигена считают его предельное разведение, в котором он связывается со специфическими антителами, иммобилизированными на твердой фазе (в лунках планшета) и вызывает окисление субстрата (развивается синее окрашивание). При этом интенсивность окрашивания должна уменьшаться с разведением антител. В лунках с нормальной сывороткой(контроль специфичности), допускается слабоголубое окрашивание, исчезающее до разведения диагностикума 1100. Автоматический учет результатов реакции проводят по отношению оптической плотности(ОП) испытуемой сыворотки к таковой контрольного (нормального) иммуноглобулина,путем измерения содержимого лунок на спектрофотометре при длине волны 405 нм. При этом результаты считают положительными, если 4 ОП 405 испытуемой сыворотки в 2 и более раз превышает таковую контрольного (нормального) иммуноглобулина. ОП 405 положительных проб должна быть не ниже 0,150. Таблица 2 Практическое применение прямого сэндвичварианта ТФ-ИФА для выявления антител в сыворотках крови вакцинированных животныхп/п Сыворотки от вакцинированных животных Крупный рогатый скот Лошади Ослы Козы Овцы Собаки Кролики Сыворотки от интактных (не вакцинированных) животных Крупный рогатый скот Лошади Козы Овцы Собаки Кролики Сыворотки животных вакцинированных гетерологичными антигенами Против болезни Ауески Против чумы плотоядных Против гепатита Против листериоза Против чумы мелких жвачных животных Контрольные препараты Иммуноглобулин специфических Примечание - - - результат отрицательный Как видно из данных, представленных в таблице 2, положительные результаты в сэндвич- варианте ТФ-ИФА были зарегистрированы только при внесении в лунки полистироловой пластины сывороток и иммуноглобулина специфического,содержащих антирабические антитела,при отрицательной реакции с гетерологичными и нормальными (контрольными) сыворотками и иммуноглобулинами,а также отсутствии ложноположительных,либо сомнительных результатов. Так,тестирование сывороток крови вакцинированных животных с помощью сорбированного на полистироле антиидиотипического иммуноглобулина и пероксидазного конъюгата антиидиотипического иммуноглобулина позволяло нам выявлять антирабические антитела в титрах, составивших от 1200 - 11600 соответственно. Титр антирабических антител в контрольном специфическом иммуноглобулине составил 112800. Таким образом, на основании результатов проведенного исследования можно сделать следующее заключение предлагаемый способ получения поликлональных антиидиотипических антител позволяет получить антиидиотипические антитела, которые имитируют вирусные антигены бешенства, так как положительно реагируют с антирабическими антителами в диагностических реакциях (реакция диффузионной преципитации,иммуноферментный анализ). В тоже время являются специфичными, так как не реагируют с видоидентичными и видогетерологичными нормальными сыворотками и сыворотками полученными на гетерологичные антигены в диагностических реакциях (реакция диффузионной преципитации, иммуноферментный анализ). Данные показатели позволяют рассматривать антиидиотипические антитела в качестве кандидатов в препараты диагностических тестсистем для выявления антирабических антител. Таким образом, на основании результатов проведенного исследования можно сделать следующее заключение - сэндвич- вариант ТФИФА с использованием антиидиотипических антител и его иммунопероксидазного конъюгата,специфических к антирабическим антителам является специфичными и чувствительным методом, позволяющим эффективно выявлять антирабические антитела в сыворотках вакцинированных животных и препаратах иммуноглобулинов в течение 5 ч. Источники информации, принятые во внимание при составлении описания на изобретение к заявке на выдачу патента РК на Способ детекции антирабических антител с помощью прямого сэндвичварианта твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ-ИФА) на основе антиидиотипических иммуноглобулинов 1) , Е. .... 4. .,1996. . 417-422. 2) Сазанова Э.Я., Кузнецова СВ., Маслов Е.В.,Кузнецов П.П., Иванов Иммуноферментный анализ при индикации вируса бешенства и определении уровня антирабических антител // Ж. Ветеринария, 1991, 8, с.62-64. 3) Недосеков В.В., Вишняков И.Ф., Жестерев В.И. и др. Титрование антирабических антител с помощью теста ингибиции фокусов флуоресценции// Ветеринария.-1998. -7.-с.28-30. 4) Сельникова О.П., Моисеева А.В., Антонова Л.А., Маричев И.Л. Изучение реактогенности и серологической активности инактивированной антирабической вакцины Верораб //Бюллетень Вакцинация. Новости вакцинопрофилактики(2004 , ). 6) Патент на изобретение 2254575 Способ титрования антирабических вируснейтрализующих антител. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ обнаружения антирабических антител с помощью прямого сэндвич - варианта твердофазного иммуноферментного анализа (ТФИФА) на основе антиидиотипических иммуноглобулинов, включающий сенсибилизацию полистироловых планшет антиидиотипическими иммуноглобулинами, внесением исследуемых и контрольных сывороток и детекцию наличия антирабических антител в исследуемых сыворотках при помощи пероксидазного конъюгата антиидиотипических иммуноглобулинов и субстратно-индикаторного раствора.