Способ получения антиидиотипических антител к альфа-фетопротеину

(51) 12 21/00 (2009.01) 07 16/00 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Расширение арсенала средств для коррекции иммунного состояния организма достигается тем,что в способе получения антител, включающем фракционное осаждение белков сыворотки крови сульфатом аммония,отделение осадка центрифугированием и очистку выделенных антител,согласно изобретению,выделяют антиидиотипические антитела к альфафетопротеину, очистку выделенных антител осуществляют гель-фильтрацией, а в качестве биологического материала используют сыворотку крови, лимфу, гемолимфу женский особей в состоянии формирования эмбриона у млекопитающих или в период лактации, сыворотку молока, яйца птиц или икру рыб сыворотку крови,молока, молозиво, лимфу, гемолимфу организма донора после иммунизации его антителами к альфафетопротеину или их -фрагментами белковые компоненты молозива и/или сыворотки молока биологические продукты синтеза в культуре клеток и/или тканей эмбриона белковые компоненты яиц животных и птиц, икры рыб.(76) Францев Александр Павлович Францева Ирина Александровна(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИИДИОТИПИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНУ(57) Изобретение относится к биологии, а именно к биотехнологии и может быть использовано в различных областях медицины, ветеринарии,иммунологии, фармакологии и косметологии. 15693 Изобретение относится к биологии, а именно к биотехнологии и может быть использовано в различных областях медицины,ветеринарии, иммунологии, фармакологии и косметологии. Известен способ получения препарата для внутривенного введения,содержащего иммуноглобулин, включающий концентрирование фракции Ш спиртового метода Кона ультрафильтрацией при величине рН 3,5-5,0,отмывку от этанола,заключительное концентрирование раствора,добавление стабилизатора,установление содержания иммуноглобулина в растворе 5 и величины рН 3,55,0, стерилизующую фильтрацию и высушивание. Перед добавлением стабилизатора проводят восстановление гидратных оболочек иммуноглобулина методом молекулярной фильтрации путем создания градиента концентрации низкомолекулярных веществ по разные стороны полупроницаемой мембраны, в качестве которой используют ультрафильтрационную мембрану с пределом отсечения по молекулярной массе менее 100000 Да или диализные вискозные оболочки (патент РФ 2122864, кл. А 61 К 39/395, 1998). В сумме получаемых иммуноглобулинов отсутствуют целевые иммуноглобулины антиидиотипические к альфа-фетопротеину антитела из-за несоблюдения временных параметров и выбора пола доноров, при которых необходимые белки присутствуют в плазме крови. Известен способ выделения иммуноглобулинаиз сыворотки крови кур, в котором осаждение иммуноглобулинов проводят полиэтиленгликолем молекулярной массой 6000 Да. Процесс выделения иммуноглобулинов включает в себя диализ,благодаря которому препараты белка отделяют от полиэтиленгликоля (а.с. СССР 1695931, кл. А 61 К 39/00, 1989). Указанный способ обеспечивает высокий выход продукта, однако он весьма длителен по времени,так как включает несколько фаз образования осадка при добавлении новых порций полиэтиленгликоля и диализ готового продукта от фосфатного буфера. Кроме того, при осуществлении способа получения целевых иммуноглобулинов не учитывался фактор времени, при котором в крови птиц присутствуют антиидиотипические к альфафетопротеину антитела в максимальной концентрации. Известен способ получения иммунорегуляторного глобулина путем фракционного осаждения белков сыворотки крови человека сульфатом аммония, отделение осадка,растворение его в буферном растворе с последующим диализом и стерилизации продукта. В качестве сырья используют полиспецифические сыворотки периферической крови женщин,рожавших более двух раз, содержащие анти -антитела, а к раствору иммуноглобулина после диализа добавляют ЭДТА и глюкозу в конечной концентрации 0,7 - 0,9 и 2 - 5 соответственно, и 2 стерилизуют или лиофильно высушивают (патент РФ 2122863, кл. А 61 К 30/395). Способ позволяет получить препарат иммуноглобулинов,обладающий иммуномодулирующим (супрессорным) действием на иммунокомпетентные клетки и который может храниться без потери активности в течение 6 месяцев. Целевым продуктом, получаемым согласно известному способу, являются анти -А-антитела. Получение антиидиотипических к альфафетопротеину антител таким способом затруднительно из-за того, что не учитывается фактор времени, когда в крови женщин или самок животных находится максимальная концентрация целевых иммуноглобулинов - антиидиотипических к альфа-фетопротеину антител. Задачей изобретения является получение целевых антиидиотипических антител из различного биологического сырья, в качестве которого используются физиологические жидкости и/или ткани особей женского рода человека и животных в строго определенный период времени,определяемый физиологическим состоянием доноров, когда в них отмечается максимальное содержание целевого продукта. Расширение арсенала средств для коррекции иммунного состояния организма достигается тем,что в способе получения антител, включающем фракционное осаждение белков сыворотки крови сульфатом аммония,отделение осадка центрифугированием и очистку выделенных антител,согласно изобретению,выделяют антиидиотипические антитела к альфафетопротеину, очистку выделенных антител осуществляют гель-фильтрацией, а в качестве биологического материала используют сыворотку крови, лимфу, гемолимфу женский особей в состоянии формирования эмбриона у млекопитающих или в период лактации, сыворотку молока, яйца птиц или икру рыб сыворотку крови,молока, молозиво, лимфу, гемолимфу организма донора после иммунизации его антителами к альфафетопротеину или их -фрагментами белковые компоненты молозива и/или сыворотки молока биологические продукты синтеза в культуре клеток и/или тканей эмбриона белковые компоненты яиц животных и птиц, икры рыб. Известно,что идиотипические признаки характеризуют аминокислотный состав и структуру вариабельной области иммуноглобулинов,определяющих специфичность антител. Получить целевые антиидиотипические антитела можно при иммунизации реципиентов иммуноглобулинами, специфичными к исходным антигенам или их -фрагментами. Антиидиотипические антитела - это обычные по структуре иммуноглобулины, соответствующие по своим физико-химическим и биологическим свойствам(молекулярная масса,групповая электрофоретическая подвижность и т.д.) антителам, присутствующим в организме, к которым могут быть применены известные способы выделения и очистки. 15693 Источником сырья для выделения антиидиотипических антител, как и для обычных иммуноглобулинов, могут быть ткани и любые физиологические жидкости организма человека и животных, такие как сыворотка крови, слюна,лимфа, молозиво и сыворотка молока, а так же и другие источники - белки яиц птиц, рептилий и икра рыб, культуральные жидкости, при использовании биотехнологических методов. Экспериментально установлено,что антиидиотипические к альфа-фетопротеину антитела в максимальной концентрации выявляются в физиологических жидкостях женских особей человека и животных в период формирования ими эмбриона (у птиц яйца или икры у не живородящих рыб), в период рождения и некоторый период после родов (отложения яйца или икры). В каждом конкретном случае, как выбор наиболее доступного и богатого, по содержанию необходимых иммуноглобулинов, источника, так и периода времени выделения, во многом определяет стратегию процесса получения и очистки антител. Так, например, иммуноглобулины из сыворотки крови могут быть получены осаждением белков этиловым спиртом по Кону ( ), которым и получают, в настоящее время, в промышленных масштабах, препараты белков сыворотки крови, в том числе и иммуноглобулины. Кроме того,источником получения антиидиотипических к альфа-фето протеину антител могут быть культуральные жидкости при биотехнологических методах, ткани эмбрионов и/или плода животных и человека, погибшего при абортах или родах, а также белки яиц птиц, морских животных и икры рыб. Предлагаемый способ реализуется при использовании указанного выше сырья, с учетом периода времени его получения, при котором в сырье содержится максимум целевого продукта,путем применения известных методов фракционирования сложных белковых композиций. Отличительной особенностью предлагаемого способа получения антиидиотипических антител к альфа-фетопротеину, которая отличает его от известных способов получения иммуноглобулинов,является не только выбор определенных источников сырья, но и выбор пола донора и необходимого периода времени (вынашивание эмбриона, яиц,икры), когда целевой продукт представлен в сырье в максимальной концентрации. Использование метода иммуноферментного анализа (ИФА), с применением обычных антител к альфа-фетопротеину,подтверждает наличие антиидиотипических иммуноглобулинов в сыворотке крови беременных женщин и животных, в молозиве и молоке, в тканях эмбрионов, белке яиц птиц (овоглобулины) и икре рыб. Получают антиидиотипические антитела к альфа-фетопротеину следующим образом. Сыворотку молока козы, полученную после створаживания и удаления казеина,центрифугируют для отделения от остатков казеина и насыщают сульфатом аммония, растворяя сухую соль в сыворотке до 20 насыщения. Дают образоваться осадку, который удаляют центрифугированием. Надосадочную жидкость досаливают до 35 насыщения,образовавшийся осадок иммуноглобулинов отделяют центрифугированием,растворяют в 0,9 растворе хлористого натрия и отделяют от сульфата аммония гель-фильтрацией,на колонке с Сефа-дексом -50, уравновешенной 0,9 раствором хлористого натрия. Наличие антиидиотипических антител к альфафетопротеину в полученной по такому способу фракции иммуноглобулинов сыворотки молока,доказывается ИФА, с применением суммы обычных или отдельных, индивидуальных по специфичности,моноклинальных антител к альфа-фетопротеину. Срок годности полученного препарата 3 года без потери активности. При необходимости получения более чистых фракций антиидиотипических антител к альфафетопротеину процесс выделения целевых иммуноглобулинов можно дополнить аффинной хроматографией, где в качестве лиганда используют антитела к альфа-фетопротеину.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антител, включающий фракционное осаждение белков сыворотки крови сульфатом аммония,отделение осадка цетрифугированием и очистку выделенных антител,отличающийся тем,что выделяют антиидиотипические антитела к альфафетопротеину, очистку выделенных антител осуществляют гель-фильтрацией, а в качестве биологического материала используют сыворотку крови, лимфу, гемолимфу женских особей в состоянии формирования эмбриона у млекопитающих или в период лактации, сыворотку молока, яйца птиц или икру рыб сыворотку крови,молока, молозиво, лимфу, гемолимфу организма донора после иммунизации его антителами к альфа фетопротеину или их -фрагментами белковые компоненты молозива и/или сыворотки молока биологические продукты синтеза в культуре клеток и/или тканей эмбриона белковые компоненты яиц животных и птиц, икры рыб.