Антиидиотипические антитела к альфа-фетопротеину, используемые для лизиса клеток

(51)7 61 39/395 ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в различных областях медицины и ветеринарии. Возможность лизиса измененных клеток достигается путем применения антиидиотипических антител к -фетопротеину человека или животныхи. 14142 Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в различных областях медицины и ветеринарии. Используемые в настоящее время методы воздействия на измененные, трансформированные клетки (химиотерапия, лучевая терапия) не избирательны и в одинаковой степени вредно действуют как на клетки, обуславливающие заболевание, так и на обычные, нормальные клетки организма. Известно, что антитела обладают способностью избирательно связываться с клеточными рецепторами-антигенами и при участии компонентов комплемента вызывать лизис таких клеток-мишеней (А. Роит, Дж. Брестофф, Д. Мейл. Иммунология. М. Мир, 2000, с. 61-62). В настоящее время интерес многих исследователей проявляется к особым рецепторам на поверхности клеток, служащих для взаимодействия с фетопротеином - белком, обнаруживаемым в организме человека и животных, при росте и делении клеток при эмбриогенезе, репаративных процессах( . 1974, . 20, . 3-37), а также при образовании некоторых видов опухолей( М. , 1994,20, . 6, . 1650). Предполагается, что антитела к рецепторам фетопротеина могут вызвать цитотоксическое действие на измененные, трансформированные клетки,имеющие такие рецепторы. Известны исследования, указывающие на возможность оказания моноклональными антителами, избирательно связывающимися с рецептором к-фетопротеину на поверхности опухолевых клеток,прямого цитотоксического действия. Обнаружено, что антитела к рецептору фетопротеина могут повышать противоопухолевый иммунитет, усиливая антителозависимую клеточную цитотоксичность клеток-эффекторов в отношении опухолевых клеток. Введение в организм реципиента антител к рецепторам -фетопротеина (структурно близким к антиидиотипическим антителам к -фетопротеину) может вызвать комплемент-зависимый лизис клеток, имеющих такие рецепторы (Северин С.Е., Родина А.В., Ницветов М.Б. и др. Моноклональные антитела к рецептору альфа-фетопротеина для регуляции противоопухолевого иммунитета // Тезисы второй международной ассамблеи Новые Медицинские Технологии. 2000. . -. ). Вместе с тем иных сведений об использовании антиидиотипических антител к -фетопротеину для избирательного, комплемент-зависимого лизиса измененных клеток не обнаружено. Сущность предлагаемого изобретения по использованию антиидиотипических антител для избирательного, комплемент-зависимого лизиса клеток, отличающихся по гистоморфологическим признакам от нормальных клеток, заключается в введении в организм реципиента антиидиотипических антител к -фетопротеину человека или животных,причем в осуществлении комплемент-зависимого лизиса измененных клеток-мишеней участвуют 2 компоненты комплемента, имеющиеся в крови и физиологических жидкостях организма реципиента,а при использовании антиидиотипических антител к-фетопротеину наружно, для импрегнации слизистых тканей и кожи реципиента, дополнительно к антиидиотипическим антителам к -фетопротеину добавляют необходимые в этом случае компоненты комплемента. В ходе экспериментальной проверки особенностей использования антиидиотипических антител к-фетопротеину установлено, что указанные антитела проявляют сродство только к особым морфологическим структурам на поверхности измененных клеток и не проявляют специфичности к структурам клеточных поверхностей нормальных, не измененных клеток тканей человека и животных. Предлагаемое использование антиидиотипических антител к -фетопротеину человека и животных позволяет осуществлятьиизбирательный, комплемент-зависимый лизис клеток,отличающихся по гистоморфологическим признакам от нормальных клеток, в том числе опухолевых,без какого-либо влияния на другие, нормальные клетки организма. Получают антиидиотипические антитела к фетопротеину известными методами, например,спиртовым фракционированием белков сыворотки крови по методу Кона ( Е, 1950), после предварительной иммунизации человека или животных клеточными рецепторами или антителами к генноинженерному или природному -фетопротеину. Изобретение поясняется фотографиями, где на фиг. 1 показано сосудистое образование у пациента на фиг. 2-5 представлена динамика процесса разрушения новообразования на фиг. 6-9 - изменение новообразования при воздействии смеси из равных количеств антиидиотипических антител к фетопротеину и компонентов комплемента на фиг. 10-15 - результаты инкубации клеток периферической крови больных лейкозом. Используют антиидиотипические антитела к фетопротеину для избирательного, комплементзависимого лизиса клеток, отличающихся по гистоморфологическим признакам от нормальных клеток организма следующим образом. Пример 1 Больной Г., возраст - 56 лет, (амбулаторная карта 5117006), пациент поликлиники МВД г. Алматы,стоит на учете у врача-онколога. Больному Г. в 1993 г. была проведена близкофокусная рентгенотерапия по поводу базалиомы кожи лба справа. В 1993 г. проведено оперативное лечение по поводу гиперкератоза левой ушной раковины, цитологическое заключение плоскоклеточный рак. При осмотре онкологом больного Г. в 1994 году отмечалось два места гиперкератоза кожи на шее справа, которые к концу 1998 г. слились между собой в единое новообразование размером 1,5 х 0,9 х 0,8 см, выступающее над уровнем кожи шеи, хорошо различимое на фиг. 1. 14242 Кроме того, под кожей, на груди больного Г., в районе левого соска, имелось сосудистое образование размером 0,6 х 0,7 см, выступающее на 0,7 см(фиг. 1). В период времени с 1994 г. по декабрь 1998 г. больному Г. лечения по поводу новообразований не проводилось. Для воздействия на новообразования, локализованные на коже шеи и в районе левого соска больного Г., использовали смесь из равных количеств антиидиотипических антител к -фетопротеину и полного набора компонентов комплемента. Указанной смесью пропитывались небольшие марлевые тампоны, которые накладывались непосредственно на новообразования в районе шеи и соска, тампоны сверху покрывались полиэтиленовой пленкой для снижения скорости высыхания,закреплялись при помощи полосок лейкопластыря и оставались на теле на 2 часа. Указанная процедура проводилась два раза в день в течение одного месяца. В течение указанного периода времени происходило разрушение новообразования на шее больного Г. и отделение его верхней части от уровня кожи. Динамика процесса разрушения новообразования на коже шеи показана на фиг. 2-5. Микроскопическое исследование отделившейся части новообразования от кожи шеи показало наличие в изучаемом материале массы кератина с кальцинатами и подвергнутых лизису клеток-теней. Опухолевых клеток в отделившейся части не найдено (биопсия 500 от 29.01.1999). На основании результатов микроскопического исследования хирургически иссеченного основания новообразования на коже шеи поставлен диагноз кератоакантома с дисплазией эпителия и начальной малигнизацией (биопсия 1496 от 08.02.1999). На фиг. 6-9 показаны результаты месячного воздействия смеси из равных количеств антиидиотипических антител к -фетопротеину и компонентов комплемента на новообразование на коже груди в районе левого соска больного Г. Как видно из данных фиг. 6-9, в ходе воздействия смеси из антиидиотипических антител к -фетопротеину и компонентов комплемента на новообразование в районе соска изменений в форме или его геометрических размерах не отмечено, так как оно находилось под нормальными, не измененными клетками эпителия кожи, на которые смесь из антиидиотипических антител к -фетопротеину и компонентов комплемента не действует, т. е. имеет место избирательный лизис только измененных, опухолевых клеток и абсолютная нейтральность смеси из антиидиотипических антител к -фетопротеину и компонентов комплемента к нормальным клеткам эпидермиса. В ходе микроскопического исследования хирургически иссеченного новообразования под эпителиальными клетками кожи груди, в районе левого соска, установлено изменение клеток ткани кровенос ного сосуда - гемангиома (биопсия 1496 а от 08.02.99). Пример 2 В экспериментахпо введению в организм антиидиотипических антител к -фетопротеину одной группе лабораторных крыс из шести животных с привитой асцитной опухолью яичников подкожно в течение трех дней вводили по 0,5 мл изотоничного раствора антиидиотипических антител козы против козьих антител к -фетопротеину человека с концентрацией белка в растворе 0,5 мг/мл. В качестве контрольных животных использовались крысы с привитой асцитной опухолью яичников, которым антиидиотипические антитела к фетопротеину не вводили. На четвертый, пятый и шестой день от начала эксперимента забивали по две крысы из экспериментальной группы животных и по одному животному из контрольной. Из тел животных при помощи пункции извлекались клетки опухолей, из которых готовились окрашенные мазки и исследовались под микроскопом для обнаружения разрушенных лизисом клеток. Среди клеток асцитной опухоли яичников крыс из контрольной группы разрушенных клеток практически не наблюдалось, отмечалось присутствие в поле зрения одной-двух разрушенных клеток и число таких разрушенных клеток не возрастало в последующие дни проведения эксперимента. Среди клеток асцитных опухолей яичников, выделенных из тел забитых животных экспериментальной группы, на четвертый, пятый и шестой день эксперимента отмечалось наличие клеток-теней следов лизиса опухолевых клеток, причем число разрушенных лизисом клеток в поле зрения микроскопа нарастало к концу эксперимента и достигало 8 , от числа неповрежденных клеток опухоли. Примерно одинаковая динамика нарастания числа клеток, подвергнутых лизису, отмечалась для клеток асцитных опухолей яичников в каждой паре забитых крыс из экспериментальной группы. Опыт проводили в двух повторностях, результаты которых совпадали между собой. Таким образом, подкожное введение животным экзогенных, готовых антиидиотипических антител к -фетопротеину, по принципу защиты организма сывороткой приводит к лизису измененных, опухолевых клеток. Работа по изучению возможности индукции в организме крыс с привитой асцитной опухолью яичников собственных антиидиотипических антител к -фетопротеину, по принципу вакцинации, проводилась с использованием очищенных козьих антител к -фетопротеину. Трем крысам с привитой асцитной опухолью яичников из экспериментальной группы внутрибрюшинно вводили стерильный раствор козьих антител к -фетопротеину человека. Другой группе из трех крыс с асцитной опухолью яичников, используемой в качестве контрольной, в тот же день внутрибрюшинно вводили равное 3 14142 количество стерильного раствора нормального человеческого -глобулина. На восьмой день от начала эксперимента крысы забивались, из их тел извлекались клетки опухолей,среди которых под микроскопом выявлялись клетки-тени, являющиеся признаками процесса лизиса клеток опухоли. Поиск поврежденных в результате лизиса клеток асцитной опухоли яичников среди крыс контрольной и экспериментальной групп показал, что в мазках клеток опухолей из контрольной группы имеются отдельные разрушенные клетки, тогда как в препаратах мазков клеток опухолей из экспериментальной группы крыс число разрушенных лизисом клеток асцитной опухоли яичников достигало 6 . Эксперимент проводился в двух повторностях,имевших одинаковые результаты. Этими экспериментами показана возможность индукции синтеза собственных антиидиотипических антител к -фетопротеину, на принципах вакцинации, при введении в организм реципиента иммуногенных соединений, например антител или их фрагментов, для синтеза целевых (антиидиотипических к -фетопротеину) иммуноглобулинов. Пример 3 Исследования цитолитической активности смеси из антиидиотипических антител к -фетопротеину и компонентов комплементапроводились на одиннадцати видах коротко живущих культур клеток, в число которых входили клетки периферической крови пятерых больных лейкозом, клетки перевиваемой мышиной опухоли Эрлиха, клетки асцитной опухоли яичников, кровь больных псориазом и анемией. В качестве контроля во всех случаях использовались клетки периферической крови здоровых людей или гомологичных животных. Образцы клеток крови смешивали с пятикратным по объему количеством питательной среды 199,в которую однократно вводили смесь из равных количеств антиидиотипических антител к фетопротеину и компонентов комплемента. Инкубация препаратов клеток проводилась в СО 2 инкубаторе при 36 С. В течение инкубации из образцов клеток через каждые 0,5 часа брались аликвоты, из которых приготовлялись мазки для окрашивания клеток и последующей микроскопии их морфологического состояния. Установлено, что в культуре клеток периферической крови, взятой у больных псориазом, так же, как и больных анемией, при инкубации их в смеси антиидиотипических антител к -фетопротеину и необходимых в этом случае компонентов комплемента у отдельных клеток имеют место нарастающие в течение времени инкубации морфологические изменения структуры, такие, как увеличение размера их ядер и образование в них глыбчатых структур хроматина. Однако гибели таких клеток в результате лизиса в течение всего процесса инкубации не отмечалось. Обнаружение в периферической крови таких клеток, морфологическое строение которых меняется от воздействия на них антиидиотипических антител к -фетопротеину и компонентов комплемента,может служить диагностическим признаком наличия в исследуемом организме серьезных системных нарушений. Результаты инкубации клеток периферической крови больных лейкозом показаны на фиг. 10-15. В культуре клеток крови лейкозных больных через три часа инкубации обнаружен избирательный лизис бластных (трансформированных) клеток, с появлением ядер-теней остается остров ядра в виде теневых очертаний - следы разрушенных лизисом клеток. Таким образом, в препаратах крови лейкозных больных на фоне достаточного количества нормальных, неизмененных клеток, выявлен эффект избирательного лизиса -гибели патологически измененных бластных клеток, выражающийся в виде остаточных теней - контуров, не воспринимающих основной краситель - Гимза-Романовского, окрашивающий ядерные структуры. Как видно из данных фиг. 10-15, антиидиотипические к -фетопротеину антитела и компоненты комплемента избирательно действуют только на отдельные клетки крови больных лейкозом, тогда как другие, находящиеся рядом клетки, остаются неповрежденными. Неповрежденными в течение всего времени инкубации оставались и клетки крови доноров. В культурах клеток, состоящих только из измененных клеток - культивируемые раковые клетки человека или животных, наблюдалась тотальная гибель клеток в результате их лизиса. В большинстве случаев лизис измененных клеток отмечался после трех часов инкубации их с антиидиотипическими антителами к -фетопротеину и компонентами комплемента, однако гибель клеток асцитной опухоли яичников наблюдалась только после шести часов воздействия на них испытуемой смеси из антител и компонентов комплемента. Таким образом, антиидиотипические антитела к-фетопротеину в сочетании с компонентами комплемента позволяют проводитьиизбирательный лизис измененных клеток тканей человека и животных, имеющих на поверхности клеточных стенок структуры, отличающие их от обычных клеток организма, что может быть использовано в целях диагностики, профилактики и лечения заболеваний, а также для применения в научных экспериментах. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Применение антиидиотипических антител к фетопротеину человека или животных для лизиса измененных клетоки.