Способ получения антигена для серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота

(51) 61 39/40 (2006.01) 01 33/53 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ при температуре 37 С, выдерживают в течение 2-х часов при периодическом взбалтывании,центрифугируют взвесь при 4000-5000 об/мин,ресуспензируют бактериальную массу в стерильных условиях в 0,5 фенолизированном физиологическом растворе до прежней концентрации и разбавляют равным объемом молочного буфера. Предлагаемый способ позволяет получить корпускулярный цветной антиген,который характеризуется наличием агглютинирующих свойств при постановке роз бенгал пробы и реакции микроагглютинации и высокой активностью в роз бенгал пробе. При выявлении специфических агглютинирующих противотрихофитийных антител в роз бенгал пробе с цветным антигеном легко проводится визуальный учет реакции, результаты реакции проявляются в образовании агглютинатов в виде мелких или крупных визуально отчетливо заметных на белом фоне хлопьев розового цвета при просветлении реакционной смеси. Использование предлагаемого способа позволит получить активный и специфичный антиген с целью использования в роз бенгал пробе для серологической диагностики трихофитии животных,имеющий простую технологию производства и легкость в стандартизации.(72) Кухар Елена Владимировна Байдюсенова Гульден Ерлановна Паламарчук Анна Владимировна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТРИХОФИТИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии,в частности к способам изготовления диагностических биопрепаратов. Технической задачей способа является разработка технологии получения активного и специфичного антигена при серологической диагностике трихофитии крупного рогатого скота,которая достигается тем, что однородные цельные клетки, полученные из вакцинного препарата ЛТФ-130, окрашивают водным раствором краски розовой бенгальской путем смешивания с бактериальной взвесью, фиксируют в термостате Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии,в частности к способам изготовления диагностических биопрепаратов. Известен ряд способов изготовления антигенов,предназначенных для серологической диагностики дерматомикозов с целью выявления в сыворотке крови животных или человека специфических антител к возбудителям болезни. Известен способ получения растворимого полисахаридного антигена дерматомицета, который получают осаждением этанолом культурального фильтрата Т. . Данный антиген синтезируется при культивировании дерматомицета, и является экстрацеллюлярным полисахаридом, одним из компонентов которого является галактоманнан, . 53. . 1991. . 181-193. Известен способ получения активного и специфичного растворимого антигена с целью использования в серологической диагностике трихофитии сельскохозяйственных животных. При получении антигена сырая мицелиальная масса гриба,полученная глубинным культивированием в течение 15 суток,отмывается от культуральной жидкости и подвергается фенольно-водной экстракции с последующим осаждением полисахариднобелкового комплекса двойным объемом этанола при низких температурах. Полученный растворимый антиген характеризуется наличием преципитирующих свойств при постановке реакции преципитации и достаточно высокой активностью в иммуноферментном анализе Патент РК 24309 Способ получения антигена из дерматомицетов для серологической диагностики // Национальный институт интеллектуальной собственности Комитета по правам интеллектуальной собственности МЮ РК. - Астана, 2011. - Опубл. 15.07.2011.- Бюлл. 7. К общим недостаткам приведенных способов относится то, что вышеназванные антигены являются растворимыми, употребляются для постановки реакций РСК, РП, РНГА, ИФА и не могут быть рекомендованы для применения в агглютинирующих тестах, так как там используются корпускулярные антигены. При выявлении агглютинирующих антител в реакции агглютинации используют корпускулярный антиген, в качестве которого употребляют взвесь фрагментов мицелия и спор грибов в физиологическом растворе, профильтрованную через трехслойный марлевый фильтр. Густота взвеси - 100 млн. клеток/мл, убитых прогреванием в водяной бане при 70 С в течение 2 часов или карболизированных 25-ным раствором фенола Кокушина Т.М. Использование серологических реакций в диагностике грибковых заболеваний. Ленинградское отд. Медицина. 1967. с.18-27. Яблочник Л.М. Серологические исследования при трихофитии крупного рогатого скота // Бюлл. ВИЭВ. Вып. . Москва. 1972. с.26-29. Петрович СВ. Показания реакции агглютинации при трихофитии лошадей // Бюлл. ВИЭВ. В. . Москва. 1976. с.70-72. Кашкин П.Н., Лисин В.В. Практическое руководство по медицинской микологии. - Ленинград Медицина, 1983. - с.98111 При выявлении поствакцинальных агглютинирующих антител в сыворотке крови крупного рогатого скота,применяется корпускулярный антиген, в качестве которого используется взвесь клеток 7-9 дневной культуры гриба,полученной глубинным культивированием на качалке в пивном сусле. Антиген содержит измельченный мицелий культуры в физиологическом растворе Жарков И.И. Материалы по изучению поствакцинального иммунитета при трихофитии крупного рогатого скота // Автореферат диссертации на соиск. канд. вет. наук. - Москва, 1977. - с.3-15 Общим недостатком агглютинирующих антигенов, полученных из грибов, является их различная активность, которая варьирует в зависимости от вида гриба, способа их получения и типа материала, из которых они были выделены(споры или мицелий). Кроме того, данные антигены требуют проведения исследований по их стандартизации (подсчет концентрации клеток в объеме жидкости,доведение до рабочей концентрации и т.д.). Наиболее близким техническим решением по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту (прототипом) является способ получения корпускулярного антигена дерматомицета для постановки реакции агглютинации в микроварианте(РМА), который получают разведением вакцинного препарата ЛТФ-130 до концентрации 100 000 клеток в 1,0 мл и используют для постановки реакции Ин. патент РК 22877. Способ серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота // Кухар Е.В., Муканов К.К. Национальный институт интеллектуальной собственности Комитета по правам интеллектуальной собственности МЮ РК. Астана. - Опубл. 15.09.2010. - Бюлл. 9 Однако известный способ изготовления антигена для серологической диагностики имеет недостатки,т.к. при постановке РМА антительные компоненты реакции разводятся вдвое буферным раствором,учет реакции проводится через 20 часов, учет результатов реакции затрудняется выпадением практически бесцветного агглютината в виде зонтика, который сложно увидеть на дне лунок полистиролового планшета. Технической задачей изобретения является разработка технологии получения активного и специфичного антигена при серологической диагностике трихофитии крупного рогатого скота,которая достигается тем, что однородные цельные клетки, полученные из вакцинного препарата 2 ЛТФ-130, окрашивают водным раствором краски розовой бенгальской путем смешивания с бактериальной взвесью, фиксируют в термостате при температуре 37 С, выдерживают в течение 2-х часов при периодическом взбалтывании,центрифугируют взвесь при 4000-5000 об/мин,ресуспензируют бактериальную массу в стерильных условиях в 0,5 фенолизированном физиологическом растворе до прежней концентрации и разбавляют равным объемом молочного буфера. Использование цветного антигена для выявления специфических агглютинирующих противотрихофитийных антител в роз бенгал пробе позволяет легко проводить визуальный учет реакции, результаты реакции проявляются в образовании агглютинатов в виде мелких или крупных визуально отчетливо заметных на белом фоне хлопьев розового цвета при просветлении реакционной смеси,постановку реакции агглютинации осуществляют в объеме 0,03 мл, а выявление в сыворотке крови крупного рогатого скота специфичных к названному антигену агглютинирующих антител, образование которых характерно для инфекционного процесса при трихофитии, проводят в течение 4 минут. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Получение окрашенных корпускулярных антигенов Вакцинный препарат ЛТФ-130 разводят с буферным растворомдо исходного объема для получения нативного корпускулярного антигена. Окрашивание нативного антигена проводят двумя методами с использованием трех красителей генцианвиолета, фуксина, розового бенгальского красителя. Первым способом окрашивают взвесь корпускулярного антигена различными красителями в соотношении 10,1. Выдерживают раствор 1 час при комнатной температуре, пятикратно отмывают краску центрифугированием при 3000 об/15 мин,восстанавливают исходный объем антигена. Вторым способом антиген окрашивают 0,25 ным водным раствором краски розовой бенгальской путем смешивания бактериальной взвеси и раствором краски в соотношении 51. Смесь помещают в термостат и выдерживают в течение 2-х часов при периодическом взбалтывании. Затем взвесь центрифугируют при 4000-5000 об/мин в течение 20-30 минут. Бактериальную массу (осадок) в стерильных условиях ресуспензируют в 0,5 фенолизированном физиологическом растворе до прежней концентрации,разбавляют равным объемом молочного буфера с рН 3,65. Готовые окрашенные антигены хранят при -4 С. Пример 2. Определение рабочей концентрации антигена Рабочую концентрацию нативного антигена определяют постановкой реакции микроагглютинации(РМА),используя десятикратные разведения антигенов забуференным физиологическим раствором. Таблица 1 Получение разведений нативного антигена из вакцинного препарата Вакцина ЛТФ-130 Для постановки реакции в микроварианте используют полистироловые круглодонные планшеты для иммунологических реакций. Готовят двукратные серийные разведения сыворотки крови(12, 14, 18, 116, 132 и т.д.). Сыворотку в объеме по 0,05 мл вносят в каждую лунку нового ряда по 0,005 мл антигена гриба Т.в каждом разведении. Смесь антигена с сывороткой выдерживают в термостате при 37-38 С в течение двух часов. Учет реакции проводят визуально в крестах по пятибальной системе через 20 часов. При постановке РМА с различными концентрациями антигенов была отмечена та концентрация, где наблюдался заметный зонтик агглютинации в малых разведениях и равномерное уменьшение объема зонтика агглютинации в больших разведениях,отсутствие эффекта самоагглютинации, легкий учет результатов реакции, при этом титр антител достигал показателей 1256. Согласно результатам,оптимальная рабочая концентрация окрашенного корпускулярного антигена определена как 100 000 клеток/мл. Пример 3. Выявление агглютинирующих свойств цветных антигенов Для выявления агглютинирующих свойств цветных корпускулярных антигенов проводят реакцию пластинчатой агглютинации (РА на стекле). На предметное стекло наносят каплю сыворотки крови крупного рогатого скота (К),вакцинированного ЛТФ-130 в условиях хозяйства, с высокими титрами специфических антител в иммуноферментном анализе - 112 800. Сюда же добавляют каплю испытуемого корпускулярного антигена. 3 При анализе результатов РА на стекле отмечали лучшие показатели у антигена, изготовленного по второй методике. Заметная реакция агглютинации в виде образование осадка в виде мелких хлопьев,просветления жидкости и склеивания мелких хлопьев в крупные при покачивании стекла наступала через 2-3 секунды и была хорошо выражена через 5-6 секунд. Результаты РА на стекле с антигенами,окрашенными фуксином и генцианвиолетом, были менее выразительны, агглютинат был бледнорозовым или бледно-синим, практически не отличающимся от агглютината с неокрашенным антигеном, учет результатов реакции проводили до 3 минут. Пример 4. Отработка реакции микроагглютинации с цветным антигеном Для выявления специфической активности агглютинирующего антигена проводят постановку РМА. В круглодонный планшет (, Дания) вносят двойные разведения сыворотки в растворе х 1 в объеме 50 мкл, которую титруют, начиная с разведения 12 на два ряда. Затем в каждую лунку планшета вносят по 0,005 мл суспензии корпускулярного антигена. Планшет осторожно встряхивают и выдерживают в течение 2 часов в термостате при 37-38 С, затем в холодильнике при 4 С. При анализе результатов наблюдают просветление жидкости над хорошо заметным полностью осевшим на дно пробирки агглютинатом в виде перевернутого розового зонтика уже через 2 часа после постановки реакции. При встряхивании зонтик разбивается на хорошо заметные розовые хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной,бледно-розовой,т.е. происходит 100 агглютинация. При постановке реакции микроагглютинации на планшетах титр антигена составил 1128. Таким образом, выявленная активность антигена позволяет использовать его в качестве диагностикума в РМА, т.к. требуемая активность по стандартам должна быть не ниже 18. Кроме того, по сравнению с постановкой РМА с неокрашенным антигеном, здесь облегчен учет результатов, т.к. агглютинат в виде розовых хлопьев отчетливо виден на белом фоне. Пример 5. Отработка постановки роз бенгал пробы с цветным антигеном Для постановки роз бенгал пробы сыворотки крови крупного рогатого скота в дозе 0,03 мл помещают на дно чистых сухих эмалированных пластинок. Затем в каждую лунку вносят 0,03 мл роз бенгал антигена. Антиген тщательно смешивают с сывороткой в каждой лунке вначале деревянной палочкой до получения однородной смеси, потом покачивающими движениями распределяют ее по всей поверхности лунки. Реакцию проводят при комнатной температуре. В качестве отрицательного контроля используют фетальную сыворотку плода производства ,в качестве положительной сыворотки - сыворотку крови крупного рогатого скота с ярко выраженной клинической картиной трихофитии. Результаты учитывают сразу после смешивания жидкостей и не позднее 4 минут после смешивания компонентов при слегка наклонном положении пластинки. При положительном результате на белом фоне пластинок образуется осадок в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета. Положительный результат в РБА с цветным антигеном был выявлен в тех же пробах, что и при постановке РМА. При отсутствии агглютинации, в лунке с отрицательным контролем и в сыворотках крови, где отсутствуют специфические агглютинирующие антитела к возбудителю трихофитии, смесь гомогенна и равномерно окрашена, постепенно образуется осадок в виде точки. Таблица 2 Титр антител испытуемых сывороток 116 Полное просветление жидкости, агглютинат в виде перевернутого розового зонтика Полное просветление жидкости, агглютинат в виде раскрытого розового зонтика Полное просветление жидкости, агглютинат в виде раскрытого розового зонтика Пример 6. Выявление диагностической ценности цветного антигена Диагностическую ценность полученного антигена при выявлении специфических антител против возбудителей трихофитии крупного рогатого скота оценивают на 30 пробах сывороток крови в различных серологических реакциях в сравнении с клиническим методом(по наличию характерных клинических признаков). В качестве отрицательного контроля используют фетальную сыворотку плода производстваи сыворотку новорожденных животных, в качестве положительной сыворотки - сыворотку крови крупного рогатого скота с ярко выраженной клинической картиной трихофитии. Таблица 3 Анализ диагностической ценности цветного антигена в сравнительном аспекте (выборка) Результаты реакции отсутствуют отсутствуют отсутствуют отсутствуют отсутствуют отсутствуют отсутствуют отсутствуют отсутствуют Согласно полученным результатам, анализ сывороток крови крупного рогатого скота на наличие специфических антител к возбудителю трихофитии показал, что результаты роз бенгал пробы с цветным антигеном практически не отличаются от отработанных ранее серологических реакций для диагностики трихофитии крупного рогатого скота. Процент выявления специфических антител в РБП РО РО РО РО составил 23, в РМА - 20, в непрямом ИФА 27 от общего количества испытуемых сывороток. По сравнению с иммуноферментным анализом, процент выявления специфических антител в РБП с цветным антигеном составил 87,5, в РМА с неокрашенным антигеном - 75. Полученные результаты свидетельствуют о высокой диагностической ценности цветного антигена. 5 Таким образом, предложенный способ позволяет получить антиген для серологической диагностики трихофитии животных, который является более чувствительным по сравнению с антигенами,полученными известными общепринятыми способами. Использование предлагаемого способа позволит получить активный и специфичный антиген для использования в роз бенгал пробе и реакции микроагглютинации для серологической диагностики трихофитии животных и высокой диагностической ценностью в роз бенгал пробе,имеющий простую технологию производства и легкость в стандартизации. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена для серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота, включающий окраску однородных цельных клеток гриба водным раствором краски розовой бенгальской, фиксацию в термостате, выдержк у при периодическом взбалтывании,центрифугирование взвеси,ресуспензирование грибной массы фенолизированным физраствором и разбавление молочным буфером, отличающийся тем, что при получении антигена используют микроконидии гриба, полученные из вакцинного препарата ЛТФ-130.