Способ серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота

(51) 61 39/40 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ реакции,постановку реакции агглютинации осуществляют в объеме 0,05 мл (в микроварианте), а выявление в сыворотке крови крупного рогатого скота специфичных к названному антигену агглютинирующих антител, образование которых характерно для инфекционного процесса при трихофитии, проводят через 20 часов. В ячейки для микротитрования вносится по 0,05 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР) с рН 7,2-7,4. Затем в первые ячейки каждого ряда добавляется по 0,05 мл исследуемого образца, и делаются двукратные разведения. После этого в каждую лунку вносится по 0,005 мл антигена,планшет встряхивается и выдерживается 2 часа при 37 С, а затем 16-18 часов при 4 С. Учет реакции проводится визуально по общепринятой методике(в крестах). Положительными считают пробы сывороток крови,титр антител которых в РМА 18 и выше. Предлагаемый способ диагностики трихофитии крупного рогатого обладает достаточной чувствительностью и специфичностью, протекает быстро, проводится с минимальной затратой рабочего времени и средств, расходования диагностикумов и лабораторной посуды, и может применяться с целью предварительной,ориентировочной диагностики трихофитии крупного рогатого скота или выявления зараженных животных.(72) Кухар Елена Владимировна Муканов Касым Касенович(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(56) Жарков И.И. Материалы по изучению поствакционального иммунитета при трихофитии крупного рогатого скота//Автореферат диссертации на соиск. канд. вет.наук. Москва. 1977. с.3-15(54) СПОСОБ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТРИХОФИТИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности к способу диагностики инфекционных болезней животных. Технической задачей изобретения является разработка способа серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота, которая достигается тем, что для выявления специфических агглютинирующих противотрихофитийных антител в реакции агглютинации в качестве антигена используют однородные цельные клетки(микроконидии) гриба,полученные разведением вакцинного препарата ЛТФ-130 до концентрации 100 000 клеток в 1,0 мл,что позволяет легко стандартизировать результаты 22877 Изобретение относится к области ветеринарии,в частности к способу диагностики инфекционных болезней животных. В крови больных микозами обнаруживаются агглютинины,преципитины и комплементсвязывающие антитела. Кроме того, в крови накапливаются непреципитирующие аллергические антитела - реагины (кожносенсибилизирующие), блокирующие (защитные,ингибирующие антитела) и гемагглютинирующие антитела (антитела-свидетели). Лещенко В.М. Лабораторная диагностика грибковых заболеваний. М Медицина. 1982. С. 65 Известен ряд способов диагностики грибковых заболеваний, основанных на выявлении в сыворотке крови животных антител, специфичных к возбудителю болезни реакция связывания комплемента (РСК), реакция преципитации (РП),реакция агглютинации(РА),реакции гемагглютинации (РГА), реакция связывания комплемента (РСК), реакция иммунолюминесценции(РИЛ). Методы экспериментальной микологии. Справочник. Отв. редактор Билай В.И. Киев. Наукова думка. 1982. С. 406-410. Описаны способы диагностики трихофитии с помощью реакции диффузионной преципитации (РДП). Аспанидзе А.Н. Апробация методов извлечения антигенных комплексов из различных трихофитонов для изучения антигенных связей в РДП // Бюлл. ВИЭВ. Москва. 1984. Вып. 54. С. 44-45, реакции коагглютинации (РКОА) Турсункулов С.А.,Сансызбай А.Р., Толеутаева С.Т. Использование реакции коагглютинации для идентификации возбудителя трихофитии верблюдов // Материалы международной научно-практической конференции Состояние и перспективы развития ветеринарной науки и практики, посвященный государственной программе АУЛ. г. Алматы. 10 сентября 2003 г. Алматы. 2003. с. 247-249., реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), реакции встречной иммунодиффузии (РИД), иммуноэлектрофореза(ИЭФ) и метода розеткообразования Медведев Ю.А. Молекулярно-клеточные механизмы иммуногенеза при зоонозной трихофитии. Автореф. дисс.докт. мед. наук. Москва. 1988. С. 4-5, 8-27. Для выявления комплементсвязывающих антител применяют РСК, в которой антигенами служат растворимые полисахариды, белковые или комплексные вытяжки из грибниц или культуральной жидкости, хотя РСК может быть поставлена с корпускулярными и растворимыми антигенами Кокушина Использование реакции связывания комплемента в диагностике дерматомикозов. // Экспер. и клинич. исследования.- Москва. - 1956. - Т. 11. - С. 101-102. Кокушина Т.М. Использование серологических реакций в диагностике грибковых заболеваний. Ленинградское отд. Медицина. 1967. С. 18-27, 198 Кашкин П.Н. Дерматомикозы (человека и животных). Ленинград. Медицина. 1967. С. 156157, 276-279. Яблочник Л.М. Серологические исследования при трихофитии крупного рогатого 2 скота. // Бюлл. ВИЭВ. - Вып. . - Москва. - 1972. С. 26-29. Петрович С.В. РСК при трихофитии лошадей // Бюлл. ВИЭВ. - В. 32. - Москва. - 1978. С. 16-17. Хамиев С.Х. Трихофития верблюдов. Диссерт.докт. вет. наук. Алма-Ата. 1991. С. 45,165 Для выявления преципитирующих антител используют РП, постановку которой осуществляют только с растворимыми антигенами. Для постановки РП в агаровом геле требуется специально обработанный агар, исследуемая сыворотка и специфический антиген, чаще всего полисахаридной природы. Кашкин П.Н., Лисин В.В. Практическое руководство по медицинской микологии. Ленинград. Медицина. 1983. С. 98-111. Аспанидзе А.Н. Апробация методов извлечения антигенных комплексов из различных трихофитонов для изучения антигенных связей в РДП. // Бюлл. ВИЭВ. - Москва. - 1984. - Вып. 54. - С. 44-45 Для выявления агглютинирующих антител применяется реакция агглютинации. В РА используются разведенная исследуемая сыворотка,физиологический раствор и взвесь убитых грибов в качестве специфического антигена. Исследуемую сыворотку разводят в ряде стерильных пробирок. Кокушина Т.М. Использование серологических реакций в диагностике грибковых заболеваний. Ленинградское отд. Медицина. 1967. С. 18-27. Яблочник Л.М. Серологические исследования при трихофитии крупного рогатого скота // Бюлл. ВИЭВ. Вып. . Москва. 1972. С. 26-29. Петрович С.В. Показания реакции агглютинации при трихофитии лошадей // Бюлл. ВИЭВ. В. . Москва. 1976. С. 70-72. Кашкин П.Н., Лисин В.В. Практическое руководство по медицинской микологии. Ленинград. Медицина. 1983. С. 98-111 Известные способы обладают существенными недостатками, которые заключаются в том, что они требуют специальных лабораторных условий для постановки реакции, имеют большой расход реактивов и лабораторной посуды, длительны во времени (от 1-2 до 15 суток). Вышеназванные способы постановки реакции не нашли своего применения в лабораторной ветеринарной практике для диагностики дерматомикозов животных из-за трудоемкости процесса, больших затрат рабочего времени и средств, расходования диагностикумов и лабораторной посуды. К тому же применение этих диагностических тестов не вышло за рамки лабораторных испытаний,что связано со сложностью приготовления антигенов,необходимых для постановки реакции. Наиболее близким техническим решением по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту (прототипом) является способ серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота, основанный на выявлении агглютинирующих антител в реакции агглютинации, предложенной Жарковым И.И. /1977/ Жарков И.И. Материалы по изучению поствакцинального иммунитета при трихофитии крупного рогатого скота// Автореферат диссертации на соиск.канд. вет. наук. Москва. 22877 1977. С. 3-15 Способ предназначен для выявления агглютинирующих поствакцинальных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота с использованием корпускулярного антигена. Однако известный способ диагностики имеет недостатки, т.к. в качестве антигена при выявлении специфических агглютинирующих антител используется взвесь клеток 7-9 дневной культуры грибав физиологическом растворе, полученной глубинным культивированием на качалке в пивном сусле (содержащая измельченный мицелий культуры), что усложняет проведение реакции и е стандартизацию из-за различного размера частиц мицелия реакция ставится в объеме 1,0 мл по общепринятой методике, что ведет к большому расходу компонентов реакции, учет результатов проводят через сутки. Кроме того, предложенный способ предназначен для выявления поствакцинальных антител. Технической задачей изобретения является разработка способа серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота, которая достигается тем, что для выявления специфических агглютинирующих противотрихофитийных антител в реакции агглютинации в качестве антигена используют однородные цельные клетки(микроконидии) гриба,полученные разведением вакцинного препарата ЛТФ-130 до концентрации 100 000 клеток в 1,0 мл,что позволяет легко стандартизировать результаты реакции,постановку реакции агглютинации осуществляют в объеме 0,05 мл (в микроварианте), а выявление в сыворотке крови крупного рогатого скота специфичных к названному антигену агглютинирующих антител, образование которых характерно для инфекционного процесса при трихофитии, проводят через 20 часов. В ячейки для микротитрования вносится по 0,05 мл забуференного физиологического раствора(ЗФР) с рН 7,2-7,4. Затем в первые ячейки каждого ряда добавляется по 0,05 мл исследуемого образца,и делаются двукратные разведения. После этого в каждую лунку вносится по 0,005 мл антигена,планшет встряхивается и выдерживается 2 часа при 37 С, а затем 16-18 часов при 4 С. Учет реакции проводится визуально по общепринятой методике(в крестах). Положительными считают пробы сывороток крови,титр антител которых в РМА 18 и выше. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Подбор оптимального антигена для постановки РМА. С этой целью использовали грибную массу дерматомицета, живую и убитую автоклавированием, и препараты вакцины ЛТФ-130 В, неразведенные и в разведении 10 ЕД по стандарту мутности ГИСК им. Л.Ф. Тарасевича. Результаты исследований свидетельствуют о возможности использования вакцины ЛТФ-130 в разведении 10 ЕД (концентрация 100 000 кл/мл) в качестве антигена при постановке РА, т.к. при этом не наблюдается неспецифических реакций (феномена самоагглютинации) (таблица 1). Таблица 1 Результаты изучения активности сывороток крови кроликов с различными антигенами в РМА Антигены, используемые при постановке РА Живая грибная масса, не разведенная Живая грибная масса, разведенная до 10 Е Д Грибная масса, автоклавированная,не разведенная Грибная масса, автоклавированая,разведенная до 10 ЕД Вакцина ЛТФ-130, не разведенная Сыворотка крови кроликов, иммунизированных по различным схемам Схема 1 схема 2 схема 3 негативная 16400,0 16400,0 16400,0 16400,0 120480,0 Пример 2. Приготовление антигенных препаратов из вакцины ЛТФ-130 В. Корпускулярный антиген 1 готовили путем восстановления сухой вакцины ЛТФ-130 В до исходного объема фосфатно-буферным раствором(1 ФСБ). Неразведенный раствор вакцины ЛТФ 130 В использовали в качестве нативного антигена. Для получения остальных антигенов готовили разведение нативного препарата в соотношении 110 22877 Таблица 2 Получение антигенов из вакцинного препарата ЛТФ-130 Антигены Концентрация (кл/мл) Количество (мл) 1 10 000 000 1 2 1 000 000 1 3 100 000 1 4 10 000 1 5 1 000 1 Пример 3. Определение рабочей концентрации определения оптимальной концентрации (таблицы антигена из вакцинного препарата ЛТФ-130 В для 3). В качестве отрицательного контроля постановки РМА. С этой целью отрабатывали использовали раствор 1 ФСБ. постановку РМА с полученными антигенами для Таблица 3 Результаты поиска оптимальной концентрации агглютинирующего антигена для постановки РМА Номер лунки Визуальная хаагглютинат в рактеристика виде перерезультатов реакции вернутого зонтика 1 крупный зонтик выражен во всех лунках 5 жидкость жидкость мутная,мутная,осадок в осадок в виде виде пуговки пуговки Как видно из таблицы 3, оптимальной рабочей концентрацией антигена для выявления агглютинирующих антител является разведение 1100 000 кл/мл (антиген 3). Применение в РМА вакцинного препарата в концентрации 10 000 000 и 10 000 000 кл/мл не дает возможности проводить учет реакции,вследствие феномена самоагглютинации во всех лунках, в том числе в контрольных. При разведении антигена до концентрации 100 000 кл/мл возможен учет РМА,т.к. отчетливее выражен зонтик агглютинации,резче выражен переход при титрации антител отдо -. При концентрации клеток ниже 100 000 кл/мл уменьшается диаметр зонтика агглютинации или он отсутствует, что искажает результаты реакции. Пример 3. Реакция микроагглютинации проводится в ячейках 96-луночного планшета для иммунологических исследований с коническим дном в объеме 0,1 мл. В лунки планшета вносят по 0,05 мл 1 ФСБ, в первые ячейки каждого ряда добавляют по 0,05 мл исследуемого образца, и проводят двукратное разведение испытуемых сывороток крови от 12 и выше. В каждую ячейку вносят по 0,005 мл суспензии антигена (таблица 4). Планшет выдерживают 2 часа в термостате при 37 С и 16-18 часов при 4 С. В качестве положительного контроля используют сыворотку крови животных с выраженной клинической картиной трихофитии, в качестве отрицательного контролянормальную /негативную/ сыворотку крови и раствор 1 хФСБ. Таблица 4 Схема внесения компонентов для постановки РМА Компоненты реакции Сыворотка крупного скота 4 Приложение - В лунки с отрицательным контролем вносится фетальная сыворотка плода теленка и фосфатно-солевой буфер. Результаты реакции учитывают визуально и произошла агглютинация не менее чем в два креста определяют в крестах по схеме//- полное просветление жидкости и Пример 4. Изучение специфичности образование агглютината на дне лунки в виде предлагаемого способа РМА на возможность перевернутого зонтика,при встряхивании выявления агглютинирующих антител в сыворотках зонтик разбивается на хлопья,крови крупного рогатого скота. Определение//- неполное просветление жидкости и возможности использования РМА для выявления хорошо выраженный зонтик агглютинирующих антител против трихофитии в/ / - незаметное просветление жидкости, сыворотке крови крупного рогатого скота и зонтик выражен умеренно специфичность этой реакции изучали на поголовье// - едва заметное просветление жидкости, телят различных хозяйств. зонтик выражен слабо. При этом обнаружено, что в сыворотке крови/-/ - отрицательный результат, просветление животных выявляются агглютинирующие антитела жидкости не наступает, на дне лунки осадок в виде в достаточно высоких титрах. У вакцинированных пуговки. При наклоне планшета пуговка слегка животных титры агглютинирующих антител стекает вниз в виде капли, при легком встряхивании выявлены в пределах 12 - 1256. У телят с выраобразуя равномерную взвесь. женной клинической картиной трихофитии За титр антител принимается последнее выявлены титры антител от 18 до 1256 (таблица 5). разведение испытуемой сыворотки, в котором Таблица 5 Результаты исследования сыворотки крови крупного рогатого скота на наличие агглютинирующих антител Выявленные титры Отри цател ьно 12 ОАО Красноярский 95 14 7 15 АО Нура 133 54 17 11 АО Ижевский 14 3 2 4 Клиника КазАТУ им. 12 4 2 1 С. Сейфуллина АФ Родина 40 5 3 1 Итого 294 80 31 32 Как видно из таблицы 5, результаты исследований специфичности предлагаемого способа диагностики трихофитии крупного рогатого скота показали возможность выявления наличия агглютинирующих антител в сыворотках крови крупного рогатого скота методом РМА в довольно высоких титрах. 1 1 4 4 21 33 27 17 20 17 37 Пример 5. Диагностическую ценность предложенного способа диагностики трихофитии крупного рогатого скота оценивают в сравнении с общепринятым методом диагностики клиническим, с учетом проявления характерных клинических признаков (таблица 6). Таблица 6 Результаты исследования сывороток крови крупного рогатого скота в РМА Группа животных Новорожденные телята Молодняк 1 мес., неиммунизированный Молодняк 6 месяцев, иммунизированный Наличие клинических признаков отсутствуют отсутствуют отсутствуют Как видно из таблицы 6, у новорожденных животных и телят 1-месячного возраста в РМА антитела против трихофитии в диагностических титрах не выявлены. При исследовании поголовья животных,иммунизированного вакциной ЛТФ-130, в РМА процент выявления составил 37,8. Показатели титров антител иммунизированных животных,выявляемых в РМА, находятся в пределах 12 - 14. У невакцинированного молодняка в возрасте 6 месяцев,титры антител выявляются,соответственно, в 47,4 случаях. При дальнейшем наблюдении и из анамнеза заболевания установлено,что животные с титром антител 18 и выше - это явно больные или зараженные животные, у которых в течение 1-2 месяцев после исследований сыворотки крови в РМА появилась выраженная клиническая картина трихофитии. Из 26,3 телят с клинически выраженной трихофитией в РМА уровень антител находился в титрах от 18 до 1256. У животных, подвергавшихся гипериммунизации,антитела выявлены в 100 с высокими показателями титров антител - от 164 до 1256. Таким образом,предложенный способ диагностики трихофитии крупного рогатого скота показал возможность выявления наличия агглютинирующих антител в сыворотках крови крупного рогатого скота методом РМА. При этом установлено, что у зараженных животных или явно больных с клинически выраженной трихофитией в РМА титры антител выявляется в 47,4 от 18 до 1256 у вакцинированных животных в 37,5 в титрах 12 - 14, у гипериммунизированных телят в 100 в титрах от 164 до 1256. Реакция протекает быстро, обладает достаточной чувствительностью и специфичностью, проводится с минимальной затратой рабочего времени и средств,расходования диагностикумов и лабораторной посуды, и может применяться с целью предварительной, ориентировочной диагностики трихофитии крупного рогатого скота или выявления зараженных животных. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота, включающий внесение в лунки полистироловой круглодонной планшеты антигена и выявление в сыворотке крови крупного рогатого скота специфичных к названному антигену агглютинирующих антител, образование которых характерно для инфекционного процесса при трихофитии и выявление которых возможно в электролитной среде, отличающегося тем, что постановку реакции агглютинации осуществляют в объеме 0,05 мл в микроварианте, в качестве антигена используют однородные цельные клетки споры, а именно микронидии гриба, полученные разведением вакцинного препарата ЛТФ-130.