Способ получения гипериммунной сыворотки для диагностики трихофитии крупного рогатого скота

(51) 61 39/40 (2009.01) 12 1/20 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ получении гипериммунных сывороток для выявления специфических антигенов возбудителя трихофитии крупного рогатого скота, животнымпродуцентам вводится антиген в возрастающих дозах внутримышечно четырехкратно с интервалом 14 дней с использованием иммуностимулятора левомизола. Способ получения гипериммунных сывороток для серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота, включает изготовление антигенов, предварительную грундиммунизацию и гипериммунизацию бычков-продуцентов, взятие и обработку крови с последующим выделением сыворотки и е консервацией. Гипериммунизацию осуществляют четырехкратным внутримышечным введением вакцинного препарата ЛТФ-130 в дозе 5 мл в объеме 1-2-3-4 дозы с интервалом 14 дней с одновременным введением левомизола в качестве адъюванта, взятием крови через 14 дней,отделением и консервацией сыворотки. Предложенный способ позволяет получать активную и специфичную гипериммунную сыворотку для использования в качестве положительного контроля в реакции микроагглютинации,реакции непрямой гемагглютинации,реакции преципитации и иммуноферментном анализе и для выявления специфических антигенов возбудителя трихофитии крупного рогатого скота в этих серологических тестах снизить себестоимость и повысить безопасность при достижении высоких значений чувствительности получаемого продукта.(72) Щурихин Борис Григорьевич Кухар Елена Владимировна Киян Владимир Сергеевич Халикова Альфия Сафиоллаевна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(56) Жарков И.И. Материалы по изучению поствакцинального иммунитета при трихофитии крупного рогатого скота// Автореф.дисс.канд.вет.наук. Москва, 1977, с. 3-15(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПЕРИММУННОЙ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТРИХОФИТИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной микробиологии, и может быть использовано в производстве диагностических гипериммунных сывороток, используемых в качестве компонентов диагностических тест-систем. Технической задачей изобретения является разработка способа получения гипериммунных сывороток с целью использования в серологической диагностике трихофитии сельскохозяйственных животных для выявления специфических антигенов возбудителя трихофитии крупного рогатого скота в достаточном количестве с высокой концентрацией иммуноглобулинов, обеспечивающей повышение активности конечного продукта с минимальными затратами и биологической безопасности процесса,которая достигается за счет того, что, при 22489 Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной микробиологии, и может быть использовано в производстве диагностических гипериммунных сывороток, используемых в качестве компонентов диагностических тест-систем. Диагностические гипериммунные сыворотки Тихонов И.В., Рубан Е.А., Грязнева Т.Н. и др. Биотехнология. Учебник. Под ред. акад. РАСХН Е.С. Воронина. СПб. ГИОРД, 2005. с. 281-321 представляют собой сыворотки крови животных,систематически иммунизированных бактериальными или вирусными антигенами,содержащие антитела,обладающие строго специфическим действием на бактериальные токсины, патогенные бактерии и вирусы, против которых иммунизировали животных. При изготовлении гипериммунных сывороток применяют антигены Головина Н.П. Новое в биотехнологии живой грибной вакцины // Труды ВИЭВ. Т. 66. Москва. 1988. с. 86-90, специфическое действие которых усилено адъювантными веществами для активизации иммунного ответа. Адъюванты являются неспецифическими раздражителями и оказывают стимулирующее действие на иммуногенез. В качестве адъювантов могут использоваться гели гидроокиси алюминия,алюминиевые квасцы и другие вещества. Кроме того, известен способ получения специфических сывороток высокого титра от животных, иммунизированных соответствующими культурами патогенных и условно-патогенных грибов Методы экспериментальной микологии. Справочник. Киев Наукова думка, 1982. с. 410411. Антигеном для иммунизации служит гомогенная смесь из агаровой культуры гриба в физиологическом растворе. Более быстрое накопление антител наблюдается при более частом введении антигена (через 3-4 дня). Наиболее высокие титры антител достигаются в результате 23 прививочных циклов с 10-15 дневными интервалами между ними. Наиболее близким техническим решением по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту (прототипом) является получение гипериммунных сывороток от белых мышей и телят для исследования в РА и РСК Жарков И.И. Материалы по изучению поствакцинального иммунитета при трихофитии крупного рогатого скота // Автореф. дисс.канд. вет. наук. Москва. 1977. с. 3-15, которые получали иммунизацией животных в левое бедро вакциной ЛТФ-130, вакциной ТФ-130 и мицелиальным антигеном живым в дозе 0,1 мл. При постановке РА выявляли титры антител в сыворотке крови телят на 20 день иммунизации от 180 до 1320. Однако известный способ получения гипериммунной сыворотки имеет следующие недостатки е получают для научноисследовательских экспериментальных работ в небольших количествах,сыворотка имеет недостаточную эффективность конечного продукта при использовании ослабленного вакцинного штамма биологическую небезопасность при использовании живого мицелиального антигена. Технической задачей изобретения является разработка способа получения гипериммунных сывороток с целью использования в серологической диагностике трихофитии сельскохозяйственных животных для выявления специфических антигенов возбудителя трихофитии крупного рогатого скота в достаточном количестве с высокой концентрацией иммуноглобулинов, обеспечивающей повышение активности конечного продукта с минимальными затратами и биологической безопасности процесса,которая достигается тем, что, при получении гипериммунных сывороток для выявления специфических антигенов возбудителя трихофитии крупного рогатого скота, животным-продуцентам вводится антиген в возрастающих дозах внутримышечно четырехкратно с интервалом 14 дней с использованием иммуностимулятора левомизола. Способ получения гипериммунных сывороток для серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота, включает изготовление антигенов, предварительную грундиммунизацию и гипериммунизацию бычков-продуцентов, взятие и обработку крови с последующим выделениемсыворотки и е консервацией. Гипериммунизацию осуществляют четырехкратным внутримышечным введением вакцинного препарата ЛТФ-130 в дозе 5 мл в объеме 1-2-3-4 дозы с интервалом 14 дней с одновременным введением левомизола в качестве адъюванта, взятием крови через 14 дней,отделением и консервацией сыворотки. Гипериммунная сыворотка применяется как положительный контроль в реакции микроагглютинации, реакции гемагглютинации,реакции преципитации и иммуноферментном анализе и для выявления специфических антигенов возбудителя трихофитии крупного рогатого скота в этих серологических тестах. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Приготовление антигена для иммунизации животных-продуцентов В качестве антигена для гипериммунизации животных используют ЛТФ-130 -вакцинный препарат против трихофитии крупного рогатого скота,изготовленный из штамма 130(аттенуированной культуры гриба 130 (ВГНКИ), повергнутый сублимационной сушке с защитной средой,производства ФГУП Ставропольская биофабрика,г. Ставрополь). Антиген разводят стерильным физиологическим раствором из расчета 50 мл растворителя на 10 доз вакцины, используют в течение 2 часов с момента растворения для введения внутримышечно по 5 мл. Пример 2. Создание грундиммунитета В качестве животных продуцентов используют естественно восприимчивых гомологичных животных - здоровых телят черно пестрой породы. Животных предварительно выдерживают в карантине и исследуют на инфекционные 22489 заболевания, согласно действующим Основным ветеринарным правилам при заготовке животных в биологической промышленности. Телят,оказавшихся здоровыми, переводят из карантина для эксплуатации. Грундиммунизацию проводят для увеличения показателя степени нарастания титра антител в сыворотке крови животных в результате иммунизаторного раздражения при гипериммунизации, которую осуществляют путем введения антигена в области крупа двукратно в дозе 5 мл в возрасте 2 месяцев с интервалом 14 дней(согласно наставления по применению вакцины ЛТФ-130 для профилактики и лечения трихофитии(стригущего лишая) крупного рогатого скота). Пример 3. Техника получения сыворотки Телят черно пестрой породы возраста 6 месяцев,массой 300-320 кг иммунизируют антигеном в дозах 5-10-15-20 мл, который вводят четырехкратно внутримышечно в область крупа с интервалом в 14 дней с использованием в качестве адъюванта левомизола в дозе 100 мг на первое, второе и третье введение и 200 мг на четвертое введение, в общем объеме 105, 110, 115, 220 мл. Места введения антигена и крововзятия протирают дезинфицирующими растворами. Через 14 дней после последнего введения антигена проводят взятие крови в дозе 10 мл/кг массы животного. За 2-3 дня до производственного крововзятия проводят пробное крововзятие для определения титра сыворотки. После крововзятия бутыли с кровью ставят в термостат на 1-2 часа при температуре 37 С, затем при комнатной температуре - на 3-4 часа (для отделения сыворотки) и помещают в холодильник при температуре 4 С на 12-16 часов. На 2 сутки производят слив сыворотки, и е центрифугирование при 3000 об/мин в течение 10 минут. Сыворотку консервируют 5-ным раствором фенола в соотношении 110 (10,0 см 3 5-ного раствора фенола и 90,0 см 3 сыворотки) и ставят на 10 дней при температуре 4 С для отстоя. Пример 4. Контроль сывороток Берут пробу сыворотки из каждой бутыли и подвергают проверке на стерильность путем высевов на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро и активность в РМА, РГА,РИД и ИФА. Через 10 суток при условии стерильности и получении положительных результатов в РМА,РГА, РИД и ИФА сыворотку смешивают для составления серии. Под серией сыворотки для выявления специфических антигенов- возбудителя трихофитии крупного рогатого скота следует понимать количество препарата,смешанное в одной емкости,подвергнутое дальнейшей обработке в одних производственных условиях, расфасованное в ампулы или флаконы, получившее свой номер,номер госконтроля и оформленное одним документом о качестве. Полученная сыворотка для выявления специфических антигеновжелтоватая, слегка опалесцирующая жидкость, при хранении с образованием незначительного беловатого осадка, легко разбивающегося при встряхивании. Изготовленная серия сыворотки для выявления специфических антигеновдолжна быть стерильной, активной и специфичной в различных серологических тестах. После проведения контроля сыворотку разливают в стерильные пенициллиновые флаконы по 1 мл,укупоривают резиновыми пробками и закатывают металлическими крышками. Активность гипериммунной сыворотки (ГИС) оценивают в различных серологических реакциях РА в микроварианте (РМА), РП по Оухтерлони, РГА с эритроцитами кролика и барана и непрямом варианте ТИФА. Наличие агглютинирующих свойств у гипериммунной сыворотки выявляют в пластинчатой реакции агглютинации. Реакцию проводят на стекле путем смешивания капли исследуемой сыворотки и капли антигена, в качестве которого используют вакцинный препарат ЛТФ-130 в разведении 100 000 кл/мл. При покачивании стекла круговыми движениями происходит агрегирование антигена и наступает просветление жидкости, которое отмечается в течение 3-5 секунд от начала постановки реакции,т.е. с момента смешивания компонентов реакции. При постановке РП по Оухтерлони в сыворотке отмечают наличие преципитирующих антител, при этом регистрируют отчетливо выраженные две линии преципитации. При тестировании ГИС в РГА эритроцитами кролика и барана отмечают наличие гемагглютинирующей активности,наиболее выражена реакция при применении эритроцитов кролика. Характерный зонтик на 4 креста регистрируют при разведении гипериммунной сыворотки до 1128 при постановке РГА с эритроцитами барана, до 132 768 - с эритроцитами кролика. При постановке непрямого варианта ИФА отмечают высокую активность гипериммунной сыворотки и возможность выявления титров антигена при е разведении до 1204 800. Специфичность гипериммунной сыворотки исследуют в РМА, РНГА, РИД, ТИФА с различными антигенами дерматомицетов,,. , гриба, микобактерий туберкулеза,бруцелл. При тестировании ГИС в РМА с корпускулярным антигеном, в качестве которого использованы цельные клетки.130 (раствор вакцины ЛТФ-130 с концентрацией клеток 100 тыс. кл./мл в 1 мл физиологического раствора) отмечают наличие агглютинирующих антител и возможность выявления гомологичного антигена при разведении сыворотки до 1256. При использовании других антигенов не отмечали появление конгломератов и 3 22489 хлопьев (гриба, микобактерий туберкулеза, бруцелл, антигены дерматомицетов). Разведение гипериммунной сыворотки,позволяющее выявлять гомологичный антиген составил в РМА 1256, в РНГА - 1128 при постановке реакции с эритроцитами барана, до 132 768 - с эритроцитами кролика. В РИД наличие специфичного антигена выявляют при разведении ГИС до 116, напротив остальных антигенов линий преципитации не образуется. В непрямом варианте иммуноферментного анализа гипериммунная сыворотка специфически связывается с гомологичным антигеном, образуют комплекс антигенГИСантивидовой конъюгатсубстрат,легко выявляемый по наличию желто-коричневого окрашивания при разведении сыворотки до 1204 800. С остальными антигенами регистрируют отрицательный результат. Гипериммунную сыворотку для серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота хранят в закрытых помещениях, в сухом и темном месте при температуре 4 С в пределах срока годности. Срок годности препарата - 1 год. Полученная гипериммунная сыворотка характеризуется наличием агглютинирующих,гемагглютинирующих и преципитирующих свойств,обладает высокой специфической активностью в реакциях агглютинации,преципитации,гемагглютинации и иммуноферментном анализе,при этом реакция не наступает с антигенами других микроорганизмов. Таким образом, заявляемый способ имеет значительные преимущества перед известными по безопасности, себестоимости и срокам получения при достижении высоких титров готового препарата. Использование предлагаемого способа позволит получить активную и специфичную гипериммунную сыворотку с целью использования в качестве позитивной в иммуноферментном анализе, реакции агглютинации, реакции непрямой гемагглютинации и реакции иммунодиффузии и для выявления специфических антигенов возбудителя трихофитии крупного рогатого скота в этих серологических тестах,имеющую простую технологию производства и использования дешевого адъюванта. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения гипериммунной сыворотки для диагностики трихофитии крупного рогатого скота, включающий изготовление антигенов,предварительную грундиммунизацию и гипериммунизацию вакциной ЛТФ-130 бычковпродуцентов, взятие и обработку крови с последующим выделением сыворотки и ее консервацией,отличающийся тем,что гипериммунизацию осуществляют четырехкратно антигеном,приготовленным из вакцинного препарата ЛТФ-130, в дозе 5 мл в объеме 1-2-3-4 дозы с интервалом 14 дней с одновременным введением левомизола в качестве адъюванта в дозе 100, 100, 100 и 200 мл, соответственно