Способ серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота

(51) 1 33/53 (2006.01) 61 39/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ стенки гриба.130, а выявление в сыворотке крови крупного рогатого скота специфичных к названному антигену антител класса , образование которых характерно для инфекционного процесса при трихофитии, осуществляют с помощью меченных ферментом иммуноглобулинов кролика против видового анти-. Результаты ИФА проявляют хромогеном и оценивают спектрофотометрически или визуально. Положительными считают пробы сывороток крови, средняя величина оптической плотности которых не менее чем в 2 раза превосходит среднюю оптическую плотность отрицательной контрольной сыворотки. Предлагаемый способ диагностики трихофитии крупного рогатого скота является более чувствительным по сравнению с общепринятыми методами диагностики клиническим и серологическим (РА), позволяет выявлять зараженных животных в инкубационный период. Использование предлагаемого метода в ветеринарной практике позволит повысить эффективность проводимых мероприятий за счет применения непрямого варианта твердофазного иммуноферментного анализа для изучения иммунного фона и ранней диагностики трихофитии у крупного рогатого скота.(72) Кухар Елена Владимировна Муканов Касым Касенович Шенжанов Канат Толюбаевич Ескендирова Сауле Зиядиновна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) СПОСОБ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТРИХОФИТИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности к способу иммуноферментной диагностики трихофитии крупного рогатого скота. Технической задачей способа является разработка иммуноферментного анализа для совершенствования диагностики трихофитии крупного рогатого скота, которая достигается тем,что при постановке реакции в качестве антигена для сенсибилизации полистироловой планшеты используют полисахаридный антиген клеточной 20706 Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных болезней животных. Известен ряд способов диагностики грибковых заболеваний, основанных на выявлении в сыворотке крови животных антител, специфичных к возбудителю болезни реакция агглютинации (РА),реакция связывания комплемента (РСК), реакция преципитации (РП), реакции гемагглютинации(РГА), реакция связывания комплемента (РСК),реакция иммунолюминесценции (РИЛ) Методы экспериментальной микологии. Справочник. Отв. редактор В.И. Билай. Киев. Наукова думка. 1982. с.406-410. В реакции агглютинации используются разведенная исследуемая сыворотка, физиологический раствор и взвесь убитых грибов в качестве специфического антигена. Исследуемую сыворотку разводят в ряде стерильных пробирок. Во все пробирки, кроме первой и последней, вносят по 1 мл физиологического раствора. В первую пробирку вносят 2,7 мл физиологического раствора и 0,3 мл исследуемой неразведенной сыворотки. После перемешивания повторным втягиванием в пипетку из первой пробирки отбирают 2 мл и вносят в последнюю и вторую пробирки, из второй в третью и так до предпоследней, в которой остается только физиологический раствор. В качестве антигена используют взвесь фрагментов мицелия и спор грибов в физиологическом растворе,профильтрованную через трехслойный марлевый фильтр. Густота взвеси - 100 млн. клеток/мл, убитых прогреванием в водяной бане при 70 С в течение 2 часов или карболизированных 25-ным раствором фенола. Так, в случае постановки РА сывороточные антитела взаимодействуют практически лишь с поверхностными антигенами спор или других клеток гриба. Однако поверхностные антигены клеток различных грибов часто оказываются общими, что снижает специфичность РА. РА слабо выявляет антитела при поверхностных и хронических дерматомикозах. Посредством РА положительные показания улавливаются в период проявления клинических признаков и через 1-2 месяца после заражения. Показатели этих реакций угасают через 6-8 месяцев Кокушина Т.М. Использование серологических реакций в диагностике грибковых заболеваний. Ленинградское отд. Медицина. 1967. с.18-27. В реакции связывания комплемента антигенами служат растворимые полисахариды, белковые или комплексные вытяжки из грибниц или культуральной жидкости. Испытуемые позитивную и негативную сыворотки инактивируют в день постановки реакции в водяной бане при 56 С в течение 30 минут. Используют 2,5 раствор эритроцитов барана, раствор комплемента, который готовят из сухого биофабричного комплемента растворением в физиологическом растворе. Реакцию проводят в водяной бане при 37 С в объме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента). Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериолитической системе на позитивной и негативной сыворотках крови и одной исследуемой 2 сыворотке. Реакция считается положительной при задержке гемолиза на 2-4 креста в первом и втором разведениях сыворотки и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена),сомнительной - при задержке гемолиза с оценкой в один . Реакция связывания комплемента - наиболее универсальная серологическая реакция, которая может быть поставлена с корпускулярными и растворимыми антигенами. Положительные показания по РСК улавливаются в начале второй недели после проявления клинических признаков трихофитии, в разгаре болезни и в первое время после выздоровления. При постановке РСК с целью диагностики дерматомикозов с сыворотками крови кроликов и крупного рогатого скота с использованием цельных клеток гриба и ЛПС отмечается феномен антикомплементарности Кокушина Т.М. Использование серологических реакций в диагностике грибковых заболеваний. Ленинградское отд. Медицина. 1967. с.18-27, 198 Хамиев С.Х. Трихофития верблюдов. Диссерт.докт. вет. наук. Алма-Ата. 1991. с.45, 165. Постановка реакции преципитации осуществляется только с растворимыми антигенами. Для постановки РП в агаровом геле требуется специально обработанный агар, исследуемая сыворотка и специфический антиген, чаще всего полисахаридной природы. После подготовки чашки Петри в центральное углубление вносят 0,1 мл испытуемой цельной или разведенной (12) сыворотки, а в периферические - по 0,1 мл раствора антигена в разведении 1100-150. Для диагностики дерматомикозов в РП концентрация антигена должна быть равна 6 мг/мл (Аспанидзе А.Н., 1984). В течение 15 дней чашки выдерживают в строго горизонтальном положении при 4-6 С. Данная реакция менее чувствительна, чем РСК, РИГА, РАЛ,РТНГА, РИФ Кашкин П.Н., Лисин В.В. Практическое руководство по медицинской микологии. Ленинград. Медицина. 1983. с.98-111. Из всех перечисленных реакций с целью диагностики дерматомикозов применяются РА и РСК,которые не обладают достаточной чувствительностью и специфичностью, титры антител при трихофитии в этих серологических реакциях регистрируются в разгар заболевания(РСК) или же через месяц после иммунизации или появления выраженных клинических признаков с последующим снижением их уровня через 6-8 месяцев (РА) Кокушина Т.М. Использование серологических реакций в диагностике грибковых заболеваний. Ленинградское отд. Медицина. 1967. с.18-27. Описаны способы диагностики трихофитии крупного рогатого скота с помощью реакции диффузионной преципитации (РДП) Аспанидзе А.Н. Апробация методов извлечения антигенных комплексов из различных трихофитонов для изучения антигенных связей в РДП // Бюлл. ВИЭВ. Москва. 1984. Вып. 54. с.44-45, реакции коагглютинации (РКОА) Маноян М.Г. Антигенные и иммуногенные связи возбудителей трихофитии(РИД), иммуноэлектрофореза (ИЭФ) и метода розеткообразования Медведев Ю.А. Молекулярноклеточные механизмы иммуногенеза при зоонозной трихофитии. Автореф. дисс.докт. мед. наук. Москва. 1988. с.4-5, 8-27. Сообщается об использовании РПГА по Бойдену и РСК на холоду для анализа специфической иммунной реактивности организма у человека с признаками межпальцевой трихофитии с использованием белково-полисахаридного антигена из Т.Твалиашвили Г.М. Трихофития в Грузии. Автореф.канд. мед. наук. Москва. 1986. с.13. К общим недостаткам приведенных способов диагностики трихофитии, является их низкая чувствительность, что обуславливает необходимость многократного исследования животных для полного выявления всех инфицированных. К тому же, применение этих диагностических тестов не вышло за рамки лабораторных испытаний, что связано со сложностью приготовления антигенов,необходимых для постановки реакции. Кроме того,в области иммунологии микозов до сих пор не разработаны стандартные антигены и сыворотки. Одним из высокочувствительных и легко выполнимых аналитических тестов, используемых в иммунологии,является твердофазный иммуноферментный анализ(ТИФА). Иммуноферментный анализ, главным достоинством которого является высокая чувствительность и специфичность,широко используется для диагностики бактериальных, грибковых и вирусных болезней животных. В ветеринарной практике ТИФА используется для проведения массовых обследований в целях ранней диагностики инфекционных болезней, наносящих огромный экономический ущерб животноводству (бруцеллез,туберкулез, лейкоз, ящур и др.), а также в ветеринарно-санитарной экспертизе продуктов животноводства и сырья животного происхождения. В настоящее время разработаны оптимальные условия и техника постановки твердофазного ИФА для диагностики некоторых грибковых инфекций у людей, животных и растений. ИФА как способ диагностики находит свое применение в диагностике болезней грибкового происхождения,например, кандидоза Караев З.О., Бабенко Г.А.,Игнатьева С.М., Соловьева Г.И. Антигенные препараты для иммунодиагностики кандидоза // ЖМЭИ. - 1990. -7. - с.104-110. В последнее время проводятся исследования по разработке иммуноферментного анализа для диагностики дерматомикозов у различных животных и человека, позволяющие с высокой точностью дифференцировать возбудителей. Наиболее близким техническим решением по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту (прототипом) является иммуноферментный анализ, разработанный .. /1999/, . 70,1-2,1999, .7786. . , . , .. , который предназначен для диагностики трихофитии кроликов. ИФА выявляетк антигенам Т.у иммунизированных кроликов 5-, 7- и 11 -недельного возраста и имеет специфическую чувствительность и высокую прогнозирующую ценность положительного и отрицательного теста. Однако известный способ диагностики трихофитии кроликов имеет недостатки,т.к. предназначен для работы с иммунизированными лабораторными животными. К тому же возбудителем трихофитии кроликов является,имеющий одни антигены, а возбудителем трихофитии крупного рогатого скота, являющейся к тому же зооантропонозным заболеванием, передающимся от животных человеку,является, имеющий другие антигены. Технической задачей изобретения является разработка иммуноферментного анализа для совершенствования диагностики трихофитии крупного рогатого скота, которая достигается тем,что при постановке иммуноферментного анализа в качестве антигена для сенсибилизации полистироловой планшеты используют полисахаридный антиген клеточной стенки гриба.130, а выявление в сыворотке крови крупного рогатого скота специфичных к названному антигену антител класса , образование которых характерно для инфекционного процесса при трихофитии,осуществляют с помощью меченных ферментом иммуноглобулинов кролика против видового анти. Результаты ИФА проявляют хромогеном и оценивают спектрофотометрически или визуально. Положительными считают пробы сывороток крови,средняя величина оптической плотности которых не менее чем в 2 раза превосходит среднюю оптическую плотность контрольной отрицательной сыворотки. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Выделяют полисахариды клеточной стенки гриба.130. Для этой цели реклонируют вакцинный препарат ЛТФ-130 на агаре Сабуро при температуре 28 С. После формирования характерных колоний проводят пересевы в жидкую среду Сабуро, вырезая часть колонии размером 0,50,5 см 2. Глубинное культивирование проводят при температуре 28 С. Пятнадцатисуточную культуру отделяют от жидкой питательной среды фильтрованием через бумажный фильтр, промывают физиологическим раствором. Отмытую грибную массу суспендируют в 45 феноле, нагретого до 68 С в течение 30 минут. Охлажденную смесь центрифугируют при 3500 об/мин в течение 15 минут, отбирают верхний водный слой, добавляют два объма охлажденного этанола (95), тщательно перемешивают. Затем 3 20706 смесь выдерживают 16-18 часов при минус 20 С,после чего антиген осаждают центрифугированием при 3500 об/мин в течение 25 минут. Этанол сливают, осадок растворяют в 1 мл дистиллированной воды. Концентрация углеводов в жидкости, определяемая по сернокислотным методом, составляла 1 мг/мл. Пример 2. Готовят конъюгат - комплекс,состоящий из кроличьих антител противкрупного рогатого скота и фермента пероксидазы хрена. С этой целью 4 мг пероксидазы хрена ( - 2,73,0) растворяют в 1 мл дистиллированной воды,прибавляют 0,2 мл свежеприготовленного 0,1 М раствора перийодата натрия и осторожно перемешивают в течение 20 минут при комнатной температуре. Приготовленный раствор фермента диализуют против 0,001 М ацетатного буфера (рН 4,4) в течение 18 часов при температуре 4 С. Затем в полученный альдегидный раствор пероксидазы вносят 0,02 мл 0,2 М бикарбонатного буфера (рН 9,5) и сразу же прибавляют 8 мг аффинных антител(антител ккрупного рогатого скота) в 0,01 М бикарбонатном буфере (рН 9,5). Реакционную смесь выдерживают 2 ч в темноте при температуре 20 С,добавляют к ней 0,1 мл свежеприготовленного раствора боргидрида натрия и оставляют на два часа при 4 С. Затем диализуют против боратного буфера (16 часов, 4 С), прибавляют равный объем 60 глицерина в боратном буфере и хранят при 4 С. Определяют рабочий титр конъюгата методом шахматного титрования в непрямом варианте ИФА. За рабочий титр конъюгата принимают наибольшее его разведение, которое выявляеткрупного рогатого скота в концентрации не ниже 20-40 нг/мл. Конъюгат считается пригодным для использования,если имеет рабочий титр не менее 1500. Пример 3. Определяют оптимальные параметры постановки ИФА для выявления антител против трихофитии в сыворотке крови крупного рогатого скота, в котором в качестве антигена используются полисахариды клеточной стенки гриба.130. В лунки полистиролового планшета для иммунологических реакций вносят по 0,05 полисахаридного антигена гриба Т.,130 в концентрации 10 мкг/мл в ЗФР с рН 7,4. Для адсорбции антигена планшет закрывают крышкой,инкубируют при 4 С в течение 18 часов. После инкубации содержимое лунок планшета удаляют и отмывают троекратно по 1-2 минуты, заполняя лунки до верхнего края ЗФР с 0,05 твином 20(позитивной и отрицательной) и испытуемой вывороток в ЗФР-ТВ. Для этого в первый ряд чистых пробирок вносят по 0,45 мл, во второй - 0,45 мл и в третий по 0,3 мл ЗФР-ТВ. После этого в первый ряд пробирок вносят по 0,05 мл испытуемых и контрольных сывороток,тщательно перемешивают и переносят 0,1 мл в третий ряд. В третьем ряду пробирок получают разведение 1400. В две лунки планшета (А-1 и В-1) вносят по 0,1 мл разведенной 1400 контрольной позитивной 4 сыворотки, в две лунки (С-1 и -1) вносят по 0,1 мл контрольной отрицательной сыворотки, в четыре лунки - Е-1, -1 (контроль конъюгата) и -1, Н-1(контроль субстрата) вносят по 0,1 мл ЗФР-ТВ. В остальные лунки планшета вносят по 0,1 мл испытуемых сывороток в разведении 1400 в двух повторах, т.е. каждую пробу сыворотки вносят в две лунки (всего 45 проб сывороток на одну планшету). Планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 1 часа при температуре 37 С. После инкубации содержимое лунок планшета удаляют и троекратно отмывают вышеописанным способом. Во все лунки планшета, кроме лунок -1 и Н-,вносят по 0,1 мл рабочего раствора меченых ферментом антител противкрупного рогатого скота. Планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 1 часа при 37 С. Повторяют процедуру отмывки и во все лунки планшета вносят по 0,1 мл субстратной смеси. Субстратную смесь готовят непосредственно перед применением в 10 мл 0,05 М фосфатно-цитратного буфера (рН 5,0) растворяют 0,01 г ортофенилендиамина и вносят 0,05 мл 33-36-ной перекиси водорода. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в темном месте при комнатной температуре (222 С) в течение 10-15 минут. Реакцию останавливают после развития желтого окрашивания в лунках с положительным контролем путем внесения в каждую лунку планшета по 0,1 мл 2 М раствора серной кислоты. Остановка реакции характеризуется желто-коричневым окрашиванием субстратной смеси в лунках с контрольной позитивной сывороткой. Результаты анализа учитывают, если средние значения оптической плотности (ОП) реакционной жидкости в лунках с контрольной отрицательной сывороткой (К), контроля конъюгата и субстрата не более 0,2 оптической единицы (о.е.), а в лунках с контрольной позитивной сывороткой (К) не менее 0,5 о.е. Учет проводят путем измерения оптической плотности реакционной жидкости в лунках планшета на спектрофотометре( , ), при длине волны 492 нм. Результаты анализа сывороток крови крупного рогатого скота на трихофитию считают положительными, если среднее значение ОП исследуемого образца сыворотки превышает среднее значение ОП контрольной отрицательной сыворотки (К-) в 2 и более раза. Пример 4. Чувствительность предложенного способа диагностики трихофитии крупного рогатого скота оценивают в сравнении с общеизвестным методом - клиническим и РА (микрометод), в котором в качестве антигена используют цельные клетки.130. Результаты исследований клинических признаков трихофитии у 11 телят 1,5 месячного возраста и анализа образцов их сыворотки крови показали отсутствие клинических признаков и отсутствие антител против трихофитии в сыворотке крови по РА, тогда как предлагаемый способ диагностики показал наличие данных антител у 30 20706 животных. В динамике у 3-месячных телят выявлено наличие клинических признаков у 18 животных, наличие антител в диагностических титрах против трихофитии (116) в сыворотке крови по РА (45), тогда как предлагаемый способ диагностики показал наличие данных антител у 82 животных. У этих же телят 4,5-месячного возраста с наличием клинических признаков трихофитии(100) выявлено наличие антител в диагностических титрах против трихофитии в сыворотке крови по РА (73), тогда как предлагаемый способ диагностики подтвердил наличие клинических признаков и позитивные показания РА и позволил выявить 91 больных трихофитией животных, что свидетельствует о высокой чувствительности данного способа Таблица 1 Изучение специфичности методов диагностики трихофитии крупного рогатого скота при выявлении антител против трихофитии в сыворотках крови спонтанно зараженных телят в динамике Инв.Возраст телят живот 1,5 месяца 3 месяца 4,5 месяца ного клин. титры антител клин. титры антител клин. титры антител признаки призпризнаки РА ИФА РА ИФА РА ИФА наки 172 11600 12 1200 132 1200 Примечание - - и- отсутствие и наличие клинических признаков трихофитии и титра антител Результаты исследований специфичности предлагаемого способа диагностики трихофитии крупного рогатого скота показали возможность выявления наличия антител в сыворотках крови крупного рогатого скота разного возраста. Таблица Изучение специфичности методов диагностики трихофитии крупного рогатого скота Группа животных Новорожденные телята Молодняк 1 мес,неиммунизированный Молодняк 6 месяцев,иммунизированный Молодняк 6 месяцев,с клинически выраженной трихофитией Дойный гурт, 2-5 лет РА титр антител 11,24 0,1 ИФА титр антител 1550,28 Как видно из таблицы, процент выявления титров антител во всех случаях в ИФА выше, чем в РА. При исследования поголовья,иммунизированного вакциной ЛТФ-130, в ИФА выявляются титры антител в среднем 11300 у 77,4 телят, а в РА процент выявления в два раза меньше. Кроме того, показатели титров антител, выявляемых в РА, находятся в пределах 12-14. У неиммунизированного молодняка в возрасте 6 месяцев, титры антител выявляются соответственно в 47,4 и 68,4 случаях. Из 26,3 телят с клинически выраженной трихофитией в ИФА установлены высокие титры антител в сыворотке крови, а в РА уровень антител находился в низких титрах. У взрослых животных, через 1-3 года после иммунизации,в ИФА выявлены противотрихофитийные антитела в достаточно высоких титрах в 66,7, в РА титры антител имели показания 12 и выявлены всего в 37,5 случаях. У новорожденных животных антитела против трихофитии не выявлены. У телят 1 месячного возраста при отсутствии клинических признаков и 5 20706 отрицательных результатах в РА выявляются титры антител в ИФА у 52 животных, которые при последующем наблюдении заболевают трихофитией. Подобные результаты указывают на возможность ранней диагностики трихофитии у зараженных животных. Таким образом,предложенный способ диагностики трихофитии крупного рогатого скота является более чувствительным по сравнению с общепринятыми методами диагностики клиническим и серологическим(РА). Использование предлагаемого метода в ветеринарной практике позволит повысить эффективность проводимых мероприятий за счет применения непрямого варианта твердофазного иммуноферментного анализа для изучения иммунного фона и ранней диагностики трихофитии у крупного рогатого скота. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики трихофитии крупного рогатого скота, включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты антигеном и выявление в сыворотке крови крупного рогатого скота специфичных к названному антигену антител класса, образующихся при трихофитии, с помощью меченных ферментом пероксидазой хрена иммуноглобулинов кролика против видового анти-, отличающийся тем, что в качестве антигена используют полисахаридный антиген клеточной стенки гриба.130.