Способ серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота

(51) 61 39/40 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ при трихофитии, проводят визуально в течение 4 минут. Для постановки роз бенгал пробы в лунки вносят сыворотки крови крупного рогатого скота и окрашенный антиген в объеме 0,03 мл (отдельной пипеткой для каждой сыворотки). Содержимое лунок тщательно смешивается активными движениями деревянной палочкой. Пластина с хорошо перемешанным содержимым покачивается в течение 2-3 минут. Реакция учитывается невооруженным глазом в течение 4 минут. Реакция считается положительной при наличии выраженной агглютинации окрашенного антигена и просветлении реакционной жидкости. Если агглютинации нет, реакцию считают отрицательной. Предлагаемый способ дает возможность выявления агглютинирующих антител в сыворотках крови крупного рогатого скота в течение 1-4 минут,что практически сопоставимо с РА на стекле и лучше по сравнению с РМА, результаты которой можно учитывать через 20 часов, При этом результаты реакции легче визуально учитывать в связи с образованием хорошо заметного агглютината розового цвета. Реакция протекает быстро, обладает достаточной чувствительностью и специфичностью, проводится в течение короткого периода времени с минимальной затратой рабочего времени и минимумом расходования диагностикумов и лабораторной посуды, может применяться с целью предварительной диагностики трихофитии крупного рогатого скота или выявлении зараженных животных, как в условиях лаборатории, так и в условиях хозяйства.(72) Кухар Елена Владимировна Курманов Бауржан Авганович Байдюсенова Гульден Ерлановна Паламарчук Анна Владимировна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) СПОСОБ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТРИХОФИТИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к области ветеринарии,а именно, к способам диагностики инфекционных болезней животных. Технической задачей способа является разработка серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота, которая достигается тем, что для выявления специфических агглютинирующих противотрихофитийных антител предложена роз бенгал проба, которую проводят на белых чистых сухих эмалированных пластинках,предназначенных для многоразового использования постановку реакции осуществляют в объеме 0,03 мл смешиванием антигена и антител без использования дополнительных компонентов, что повышает концентрацию компонентов реакции в качестве антигена используют однородные цельные клетки(микроконидии) гриба,окрашенные водным раствором краски розовой бенгальской выявление в сыворотке крови крупного рогатого скота специфичных к названному антигену агглютинирующих антител, образование которых характерно для инфекционного процесса Изобретение относится к области ветеринарии, а именно, к способам диагностики инфекционных болезней животных. В крови больных микозами обнаруживаются антитела,обладающие агглютинирующими свойствами агглютинины и гемагглютинирующие антитела (антитела-свидетели). Известен ряд способов диагностики дерматомикозов, основанных на выявлении в сыворотке крови животных агглютинирующих антител,специфичных к возбудителю болезни. Это такие реакции, как реакция агглютинации(РГА) Методы экспериментальной микологии. Справочник. Отв. редактор В.И. Билай. Киев. Наукова думка. 1982. с.406-410, реакция коагглютинации (РКОА) Турсункулов С.А., Сансызбай А.Р., Толеутаева С.Т. Использование реакции коагглютинации для идентификации возбудителя трихофитии верблюдов// Материалы международной научно-практической конференции Состояние и перспективы развития ветеринарной науки и практики, посвященный государственной программе АУЛ. - Алматы, 2003. с.247-249., реакция пассивной гемагглютинации(РПГА) Медведев Ю.А. Молекулярно-клеточные механизмы иммуногенеза при зоонозной трихофитии. Автореф. дисс. докт. мед. наук. Москва. 1988. с.4-5,8-27,реакция латексагглютинации (РЛА) Патент 24631 РК Способ получения латексного антигена для постановки реакции латекс-агглютинации // Кухар Е.В., Никитин Е.Б., Парийчук О.Д. Национальный институт интеллектуальной собственности Комитета по правам интеллектуальной собственности МЮ РК. - Астана, 2011. - Опубл. 15.09.2011. - Бюлл. 9 Известен способ выявления агглютинирующих антител в реакции агглютинации, где используют разведенную исследуемую сыворотку,физиологический раствор и специфический корпускулярный антиген. Исследуемую сыворотку разводят в ряде стерильных пробирок. Во все пробирки, кроме первой и последней, вносят по 1 мл физиологического раствора. В первую пробирку вносят 2,7 мл физиологического раствора и 0,3 мл исследуемой неразведенной сыворотки. После перемешивания повторным втягиванием в пипетку из первой пробирки отбирают 2 мл и вносят в последнюю и вторую пробирки, из второй в третью и так до предпоследней, в которой остается только физиологический раствор. В качестве антигена используют взвесь фрагментов мицелия и спор грибов в физиологическом растворе, с густотой взвеси -100 млн. клеток/мл Кокушина Т.М. Использование серологических реакций в диагностике грибковых заболеваний. Ленинградское отд. Медицина. 1967. с.18-27. Яблочник Л.М. Серологические исследования при трихофитии крупного рогатого скота // Бюлл. ВИЭВ. Вып. . Москва. 1972. с.26-29. Петрович С.В. Показания реакции агглютинации при трихофитии лошадей // Бюлл. ВИЭВ. В. . - Москва. 1976. с.70-72. Кашкин П.Н.,Лисин В.В. Практическое руководство по медицинской микологии. Ленинград Медицина, 1983. - с.98-111 Известен способ серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота, основанный на выявлении поствакцинальных агглютинирующих антител в сыворотке крови крупного рогатого скота с использованием корпускулярного антигена, в качестве которого используется взвесь клеток 7-9 дневной культуры гриба,полученной глубинным культивированием на качалке в пивном сусле. Антиген содержит измельченный мицелий культуры в физиологическом растворе, реакция ставится в объеме 1,0 мл по общепринятой методике, учет результатов проводят через сутки Жарков И.И. Материалы по изучению поствакцинального иммунитета при трихофитии крупного рогатого скота // Автореферат диссертации на соиск. канд. вет. наук. - М. 1977. - с.3-15 Известные способы обладают существенными недостатками, которые заключаются в том, что они требуют специальных лабораторных условий для постановки реакции, имеют большой расход реактивов и лабораторной посуды, длительны во времени (от 1-2 до 15 суток) и требуют больших затрат рабочего времени и средств, в том числе на стандартизацию антигена. Наиболее близким техническим решением по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту (прототипом) является способ выявления специфических агглютинирующих противотрихофитийных антител в реакции агглютинации в микроварианте (РМА),где постановку РМА осуществляют в объеме 0,05 мл (в микроварианте), а выявление в сыворотке крови крупного рогатого скота, специфичных к названному антигену агглютинирующих антител,проводят через 20 часов. При условии положительного результата на дне пробирки появляется агглютинат в виде перевернутого зонтика, жидкость просветляется Ин. Патент 22877 РК. Способ серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота // Кухар Е.В.,Муканов К.К. Национальный институт интеллектуальной собственности Комитета по правам интеллектуальной собственности МЮ РК. Астана, 2010. - Опубл. 15.09.2010.- Бюлл. 9 Однако известный способ диагностики имеет недостатки, так как реакция ставится в специальных полистироловых круглодонных планшетах. Полистирол обладает высокой сорбционной способностью, поэтому планшет используется однократно, что повышает стоимость реакции. Постановка РМА в микрообъеме усложняет учет реакции ввиду низких концентраций специфических компонентов реакции, так как реакция проводится в равном объеме буферного раствора. Учет реакции осложняется также тем, что образующийся агглютинат (зонтик агглютинации на дне пробирки) представлен в виде едва заметного,практически бесцветного осадка и при низких титрах агглютинирующих антител возможно искажение учета РМА (ложноположительные или 2 ложноотрицательные результаты). Кроме того,предложенный способ диагностики применяется с целью предварительной,ориентировочной диагностики трихофитии крупного рогатого скота. Технической задачей изобретения является разработка способа серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота, которая достигается тем, что для выявления специфических агглютинирующих противотрихофитийных антител предложена роз бенгал проба, которую проводят на белых чистых сухих эмалированных пластинках,предназначенных для многоразового использования постановку реакции осуществляют в объеме 0,03 мл смешиванием антигена и антител без использования дополнительных компонентов, что повышает концентрацию компонентов реакции в качестве антигена используют однородные цельные клетки(микроконидии) гриба,окрашенные водным раствором краски розовой бенгальской выявление в сыворотке крови крупного рогатого скота специфичных к названному антигену агглютинирующих антител, образование которых характерно для инфекционного процесса при трихофитии, проводят визуально в течение 4 минут. Для постановки роз бенгал пробы в лунки специальных стерильных сухих эмалированных пластинок для постановки реакции вносят сыворотки крови крупного рогатого скота и окрашенный антиген в объеме 0,03 мл (отдельной пипеткой для каждой сыворотки). Содержимое лунок тщательно смешивается активными движениями деревянной палочкой. Пластина с хорошо перемешанным содержимым покачивается в течение 2-3 минут. Реакция учитывается невооруженным глазом в течение 4 минут. Агглютинация,которая происходит позже 4 минут, не учитывается. Реакция считается положительной при наличии выраженной агглютинации окрашенного антигена (мелкие или крупные хлопья розового цвета) и просветлении реакционной жидкости. Если агглютинации нет(смесь гомогенна, равномерно окрашена), реакцию считают отрицательной. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Выявление агглютинирующих свойств у цветного антигена Во флакон с лиофилизированой вакциной ЛТФ 130 вносится раствор х 1 до исходного объема. Проводится процедура окрашивания антигена специальным красителем. Концентрация антигена доводится до оптимальной рабочей концентрации. Для выявления агглютинирующих свойств цветного антигена проводится реакция пластинчатой агглютинации (РА на стекле). Для этого на предметное стекло наносится капля сыворотки крови крупного рогатого скота,вакцинированного препаратом ЛТФ-130 или больного животного с явно выраженными клиническими признаками трихофитии, с высокими титрами специфических антител в ИФА (не ниже 16400). Сюда же добавляется капля испытуемого корпускулярного антигена. Заметная реакция агглютинации наступала через 3-4 секунды и была хорошо выражена через 25-30 секунд. Визуально наблюдали образование осадка в виде мелких розоватых хлопьев, просветление жидкости до прозрачной бледно-розовой, при покачивании стекла происходило склеивание мелких розовых хлопьев в крупные интенсивно розового цвета. Пример 2. Постановка роз бенгал пробы (РБП) Для постановки РБП сыворотки крови телят в объеме 0,03 мл помещают на дно чистых сухих эмалированных пластинок для постановки роз бенгал пробы. Затем в каждую лунку к сыворотке добавляют по 0,03 мл окрашенного антигена без образования пузырьков воздуха. Содержимое лунок(цветной антигенсыворотка крови) тщательно смешивают активными движениями деревянной палочкой. Пластину с хорошо перемешанным содержимым покачивают в течение 2-3 минут. При учете РБП на белом фоне регистрируют отчетливый результат реакции агглютинации в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета или равномерно мутного осадка на дне лунок. Положительная реакция характеризуется образованием хлопьев розового цвета и просветлением жидкости в течение 1-1,5 минут. При отрицательном результате и отсутствии агглютинирующих антител смесь остается гомогенной и равномерно окрашенной в непрозрачный розовый цвет, постепенно образуется осадок в виде точки по центру лунки. Пример 3. Изучение специфичности предлагаемого способа серологической диагностики трихофитии при выявлении агглютинирующих антител в сыворотках крови крупного рогатого скота в условиях хозяйств. Определение возможности использования РБП для выявления агглютинирующих антител против трихофитии в сыворотке крови крупного рогатого скота и специфичность этой реакции изучается на поголовье телят из различных хозяйств. Для опыта отбирают сыворотки крови у телят с выраженной клинической картиной трихофитии и у клинически здоровых животных. При постановке роз бенгал пробы для исследования сывороток крови крупного рогатого скота на трихофитию помещают их на дно чистых сухих эмалированных пластинок в объеме 0,03 мл. Затем в каждую лунку вносят по 0,03 мл роз бенгал антигена. Антиген тщательно смешивают с сывороткой крови в каждой лунке с помощью деревянных палочек до получения однородной смеси, покачивающими движениями распределяют ее по всей поверхности лунки. Реакцию проводят при комнатной температуре. В качестве отрицательного контроля используют фетальную сыворотку плода производства ,сыворотки новорожденных и сыворотки крови здоровых телят 1-2 недельного возраста. В качестве положительной сыворотки - сыворотку крови крупного рогатого скота с ярко выраженной 3 клинической картиной трихофитии. Результаты учитывают не позднее 4 минут после смешивания компонентов при слегка наклонном положении пластинки. При этом обнаружено, что при постановке РБП в сыворотках крови выявляются агглютинирующие антитела у всех телят с выраженной клинической картиной (таблица 1). Таблица 1 Результаты тестирования сывороток крови крупного рогатого скота на трихофитию в роз бенгал пробеиспытуемой сыворотки Результаты тестирования сывороток В крестах Полное просветление жидкости, агглютинат в виде розового зонтика Полное просветление жидкости, агглютинат в виде розового зонтика Пример 4. Изучение диагностической ценности РБП Диагностическую ценность предложенного способа диагностики трихофитии крупного рогатого скота оценивают в сравнении с другими агглютинирующими тестами пластинчатой РА и РМА (таблица 2). Таблица 2 Результаты исследования сывороток крови больных трихофитией телят на наличие специфических антител к возбудителю трихофитии (выборка) Группа Животных(титр антител или наличие агглютината) РБП РП на стекле РМА 12 Как видно из таблицы 2, результаты роз бенгал пробы с цветным антигеном сопоставимы с результатами классических вариантов реакции агглютинации. У новорожденных животных во всех агглютинирующих тестах антитела против трихофитии в диагностических титрах не выявлены. При анализе сывороток крови телят с клинически выраженной трихофитией результаты РБП, РА на стекле и РМА подтверждают наличие клинических признаков. В одной пробе наблюдали появление кольца, что свидетельствует о том, что животное переболело или находится в инкубационном периоде. Предлагаемый способ дает возможность выявления агглютинирующих антител в сыворотках крови крупного рогатого скота. Получить результаты роз бенгал пробы можно в течение 1-4 минут, что практически сопоставимо с РА на стекле,но при этом результаты реакции легче визуально учитывать в связи с образованием хорошо заметного агглютината розового цвета. В сравнении с РМА,где используется неокрашенный антиген, и,результаты которой можно учитывать через 20 часов, РБП выигрывает по возможности учета реакции и по появлению ярко выраженного зонтика розового цвета. Реакция протекает быстро, обладает достаточной чувствительностью и специфичностью, проводится в течение короткого периода времени с минимальной затратой рабочего времени и минимумом расходования диагностикумов и лабораторной посуды, может применяться с целью предварительной диагностики трихофитии крупного рогатого скота или выявлении зараженных животных, как в условиях лаборатории, так и в условиях хозяйства. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота, включающий проведение реакции на белых чистых сухих эмалированных пластинках с лунками в объеме 0,03 мл, которая сопровождается смешиванием антигена и антител и считыванием в течении 4 минут, отличающийся тем, что в качестве антигена используют однородные цельные клетки(микроконидии) гриба,окрашенные водным раствором краски розовой бенгальской, антигены и антитела в реакции применяют без использования дополнительных компонентов,положительный результат проявляется в виде выпадения агглютината розового цвета, хорошо заметного на белом фоне.