Праймеры для диагностики описторхоза методом ПЦР

(51) 01 33/53 (2006.01) 61 10/00 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Такая тревожная ситуация по указанным паразитарным патологиям, напрямую связаны с продовольственной безопасностью, т.к. источником инвазии является речная рыба, достаточно широко представленная в рационе питания людей. Существующие методы диагностики описторхоза, обнаружение личинок гельминта в мышцах рыбы возможно при их достаточной концентрации. Наиболее актуальной задачей при исследовании описторхоза в природных очагах является точная видовая идентификация возбудителя, изучение морфофункциональных взаимосвязей паразита и дефинитивного хозяина. Для проведения эффективных исследований природных очагов гельминтозов необходим метод, позволяющий проводить такую идентификацию на всех фазах жизненного цикла паразита. Метод ПНР обладает высокой чувствительностью, позволяющий выявлять в исследуемых образцах даже единичных гельминтов,что важно в случае латентной инфекций и низкой яйцепродукции и высокой специфичностью,обусловленной подбором праймеров на уникальные для данного вида участки генома. Предложенный способ может быть использован в паразитологии для диагностики описторхоза методом ПЦР. Предложенный способ включает в себя проведение ПЦР с использованием праймеров 10 5- -3,165 5- СССС-3,322 53. Далее делают заключение о наличии в исследуемом материале возбудителя описторхоза. Предложенное изобретение позволяет быстро проводить диагностику описторхоза как у промежуточного так и у дефинитивного хозяев.(72) Абсатиров Гайса ГараповичБогомаз Денис ИгоревичКабоев Олег Константинович Матвеева Татьяна ВалерьевнаКакишев Мурат Галиханович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения ЗападноКазахстанский аграрно-технический университет имени Жангир хана Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ОПИСТОРХОЗА МЕТОДОМ ПЦР(57) Изобретение относится к паразитологии и ветеринарной биотехнологии. Последовательность олигонуклеотидов - праймеров позволяющих определять строго специфичный участок ДНК последовательности возбудителя описторхоза. В последние годы по республике отмечается неблагоприятная эпизоотическая ситуация с выраженной эпидемической проекцией по ряду инвазионных заболеваний. По данным Агентства Республики Казахстан по защите прав потребителей ежегодно в республике регистрируется до 1500 случаев заболевания описторхозом. Наиболее неблагополучными по описторхозу являются,Акмолинская,Восточно-Казахстанская,Костанайская,Павлодарская,Карагандинская,Западно-Казахстанская,Северо-Казахстанская области. Средний многолетний показатель заболеваемости описторхозом населения по РК составил 13,6 на 100 тыс. населения, в ЗКО этот показатель составляет 28,0 на 100 тыс. населения. Изобретение относится к паразитологии и ветеринарной биотехнологии. Последовательность олигонуклеотидов - праймеров позволяющих определять строго специфичный участок ДНК последовательности возбудителя описторхоза. В настоящее время общепринятым способом диагностики описторхоза у промежуточного хозяина - рыб (основного источника заражения людей) является компрессионный метод исследования мышц. Индикация половозрелой стадии паразита у дефинитивных хозяев (кошки,собаки), основана на установлении факта употребления ими в пишу потенциально зараженной рыбы, путем копрологических исследований. Известны общеупотребительные способы определения опистархоза 1. Посредством техники микроскопирования,когда тем или иным способом подготовленные ткани животного препарируют для визуализации под световым или иным микроскопом. Метацеркарии детектируют визуально.(Котельников Г.А. Гельминтологические исследования животных и окружающей среды. - М.,1984. - .46.). Основным недостатком метода является трудоемкость,не очень высокая достоверность результатов,невозможность проводить анализы сильно деградировавшего материала ограничение анализа только одной стадией жизненного цикла паразита. 2. Имунноферментный анализ., ,(1987).1392044-2049. Недостатком этого метода является высокий уровень ложноположительных и ложноотрицательных результатов,высокая трудоемкость анализа. 3. ПЦР анализ самый современный метод детекции. Особенность его заключается в том, что имеется большое разнообразие праймеров и в зависимости от конкретных последовательностей очень варьирует результат исследования.,. 200846(1) 366-368.200714.10.1128/.01323-07. Недостатком этих методик является закрытость или недостоверность опубликованных последовательностей праймеров и связанная с этим низкая эффективность детекции. Экспресс-диагностика заболевания, вызываемого, имеет важное значение в ветеринарно-санитарной экспертной практике, в особенности когда продукция - рыба поступает на рынки для продажи. В таких случаях лучше всего использовать метод полимеразной цепной реакции(ПЦР), который позволяет непосредственно с высокой степенью чувствительности и достаточно 2 быстро определить наличие ДНКв образце, позволяя решать задачи диагностики инвазионных заболеваний более эффективно. В основе ПЦР лежит многократное копирование с помощью фермента ДНКполимеразы определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя заболевания. ПЦР является прямым методом выявления возбудителя и имеет высокую степень чувствительности. Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера,специфичные для. Ограниченность использования праймеров обусловлена их видоспецифичностью. Праймеры должны быть комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, чтобы синтез ДНК,осуществляемый ДНК-полимеразой,протекал только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента. От правильно выбранных праймеров,определяющих специфичность ПЦР, зависит определение строгой видоспецифичности с их помощью можно выявить целые роды или семейства организмов. Задачей изобретения является эффективная надежная детекция опистархоза методом ПЦР. Технический результат достигается использованием синтетических олигонуклеотидов-праймеров,используемых для выявления с помощью полимеразной цепной реакции ДНК О.и имеющих следующий нуклеотидный состав 10 53165 53322 53 специфичные к консервативному участку. Результат амплификации детектируется на агарозном геле. Продукт амплификации соответствует отрезку нуклеотидной последовательности в 237 пар при использовании праймера 10 и 157 пар при использовании праймера 165. Состав реакционной смеси включал в себя следующие компоненты праймеры, буфер для проведения ПЦР реакции,1.5 М, смесь дизоксинуклеотидтрифосфатови полимераза. Программа амплификации ДНК, состоит из 42-х циклов включающая в себя 1 этап денатурация при 95 С в течении 3-х минут,2 этап отжиг при 63 С в течении 1-ой минуты и 3 этапа элонгации или синтеза при 72 С в течении 1-ой минуты. Изобретение осуществляется с использованием амплификатора для проведения ПЦР марки 5,производитель В-,США или аналогичного. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Праймеры для диагностики описторхоза методом ПЦР, включающие проведение ПЦР и анализ результата ПЦР на агарозном геле, отличающиеся тем, что для проведения ПЦР используют праймеры со следующими последовательностями 10 5 3165 5 3322 5 -3, продукт амплификации соответствует отрезку нуклеотидной последовательности в 237 пар при использовании праймера 10 и 157 пар при использовании праймера 165.