Способ ускоренной диагностики инфекционных заболеваний

(51) 01 33/50 (2006.01) 01 33/531 (2006.01) 01 33/536 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Задачей изобретения является разработка способа ускоренной диагностики инфекционных заболеваний с применением от 8 до 20 праймеров. Техническим результатом применения данного способа является проведение ускоренной ПЦР диагностики в изотермальном режиме с более высоким выходом продуктов амплификации за счет применения от 4 до 20 праймеров. Предлагаемый способ включает выделение ДНК из биоматериала с последующим проведением ПЦР диагностики в сухоблочном термостате (термоблок),либо водяной бане при температуре 60-65 С с детекцией ПЦР продуктов в стандартном програмном обеспечении флуориметра, и/или визуальным способом.(72) Айтуов Бауыржан Абдугалиевич Султанкулов Болат Мухтарович Джолдасов Адыльбек Мусабекович(54) СПОСОБ УСКОРЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ(57) Изобретение относится к сфере медицины и ветеринарии, а именно к молекулярной диагностике инфекционных заболеваний. Изобретение относится к сфере медицины и ветеринарии, а именно к молекулярной диагностике инфекционных заболеваний. На сегодняшний день,в клиническую диагностическую практику на первый план выходят методы прямого обнаружения возбудителя,основанные на выявлении ДНК или РНК. Самый распространенный метод прямого обнаружения генетического материала возбудителей инфекционных заболеваний является полимеразная цепная реакция (далее - ПЦР). Методы, основанные на ПЦР, позволяют проводить раннюю диагностику,когда другими методами (иммунологическими,бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно, что особенно актуально при социально-значимых заболеваниях,где эффективность лечения напрямую зависит от правильного и своевременно поставленного диагноза. Известен способ иммуноферментного анализа(ИФА) для диагностики инфекционных заболеваний(Морозов С.Г., Иванов Ю.Д. и др. Аллергия, астма и клиническая иммунология, 9, 1999, с.187-189). Данный способ имеет ряд существенных недостатков, таких как длительность постановки анализа (до 24 часов) и отсутствие жесткого контроля качества тест-систем. Известен способ диагностики инфекционных заболеваний на основе ПЦР ( ., .2, 5, 1995, .245-250). Данный метод получил наибольшее распространение среди молекулярно-генетических методов диагностики и имеет несколько вариантов применения, таких как ПЦР в режиме реального времени (реал-тайм ПЦР). Наиболее близким аналогом настоящего изобретения является процедура диагностики на основе вышеназванного метода Реал-тайм ПЦР. При этом, оба способа диагностики проводят в три этапа ПЦР реакции а) нагревание реакционной смеси для разделения двунитевых цепей ДНК и получения однонитевых цепей ДНК (нагревание) б) охлаждение смеси для гибридизации цепей ДНК с праймерами (гибридизация/отжиг) в) синтез дочерних цепей ДНК (элонгация).(Источники Кольман Я., Рем К.Г. Наглядная биохимия Издательство Мир, 2000 г.,5-03003304-1. стр 258-259) В соответствие с общепринятыми правилами,диагностику традиционным способом реал-тайм ПЦР проводят в трех диапазонах температур 94 С(элонгация), что невозможно осуществить без применения амплификаторов с программируемым температурным режимом(////0900 0800518000 0700018186 050000181 800500018608 18 2015). В отличие от этого, все три этапа ПЦР диагностики в настоящем изобретении проводят в 2 изотермальном (моно-температурном) режиме при 60-65 С. Данная характеристика достигается за счет применения специального фермента -ДНК полимераза, который обладает способностью раздвигать дочерние цепи ДНК на стадии элонгации, тем самым позволяя проводить диагностику в моно-температурном режиме. Это и является ключевым отличительным признаком и преимуществом настоящего изобретения. Однако стандартно применяется от 4 до 6 праймеров. Применение же от 8 до 20 праймеров способствует проведению диагностики в более сжатые срок (30-45 минут по сравнение с традиционным реал-тайм ПЦРом 60-120 минут). Задачей изобретения является разработка способа ускоренной диагностики инфекционных заболеваний у людей и животных с использованием ферментаДНК полимераза с набором 8 праймеров. ФерментДНК полимераза в настоящем изобретении обладает одним и/или несколькими и/или всеми следующими характеристиками 1) Природный производитель полимеразы микроорганизм 2) Полимераза является рекомбинантной по происхождению (получена из .) 3) Обладает 53 полимеразной активностью 4) Отсутствует 35 экзонуклеазная активность 5) Применяется для изотермальной амплификации. Изотермальная амплификация проводится при температуре от 55 до 70 С, от 60 до 65 С 6) Инактивируется при температуре 80 С 7) Молекулярный весДНК полимеразы равен от 60 000 до 74 000 дальтонов , от 63 000 до 71 000 дальтонов, от 66 000 до 68 000 дальтонов, от 66 500 до 70 500 дальтонов. В идеале, молекулярный вес равен 67 000 дальтонов /- 500 дальтонов. Решение поставленной задачи достигается за счет способностиДНК полимеразы проводить амплификацию в пределах 60-65 С, вместо обычного температурного цикла 94 С-50 С-74 С. Соответственно,отсутствует необходимость наличия и применения ПЦР-амплификаторов. Кроме того, время проведения ПЦР реакции (без учета пробоподготовки) в данном способе занимает до тридцати минут по сравнению с традиционным методом (два-три часа). При этом, предлагаемый способ позволяет получить более высокий выход ПЦР-продуктов. Техническим результатом применения предлагаемого способа является проведение ПЦР реакций в изотермальном режиме с более высоким выходом продуктов амплификации. Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами Пример 1. Клинический пример применения изобретения на практике. Выделение ДНК из биоматериала. 1) Промывают пробирки с биоматериалом щеточкой с 500 мкл нейтрального буфера 2) Автоматическим дозатором-пипеткой добавляют 100 мкл буфера 3) Автоматическим дозатором-пипеткой добавляют 600 мкл Ацетата калия и инкубировать в холодильнике 30 мин 4) Центрифугируют и отбирают супернатант автоматическим дозатором- пипеткой 5) Автоматическим дозатором-пипеткой добавляют равный объем холодного изопропанола и инкубировать в морозильнике 30 мин 6) Центрифугируют 15 мин 7) Автоматическим дозатором-пипеткой отбирают осадок для анализа 8) Автоматическим дозатором-пипеткой добавляют 1 мл 70 этанола 10) Центрифугируют 5 мин 11) Сливают супернатант и высушивают в течение 15 минут при комнатной температуре 12) Используют высушенный осадок для ПЦР реакции. Проведение экспресс диагностики 1) Подготавливают реакционную смесь с ферментомДНК полимераза и восемью специфичными праймерами 2) Проводят ПЦР диагностику в сухоблочныом термостате (термоблок), либо водяной бане при постоянной температуре 60-65 С в течение 30 минут. 3) Проводят анализ полученных ПЦР продуктов визуально и/или на автоматическом програмном обеспечении (флуориметры и тд). Нет необходимости проводить очистку,выделение и гель-электрофорез продуктов амплификации. Пример 2. Ниже приведен список инфекционных заболеваний, которые могут быть детектированы предлагаемым способом в Примере 1. Кроме того, предлагаемый способ также применим в диагностике инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных. В частности, в отношении следующих возбудителей 1. Вирус лейкоза животных 2. Вирус ящура животных 3. Сибирская язва 4. Вирус бешенства 5. Бруцеллеза 6. Птичий грипп (РНК вируса гриппа а,субтипов 5, 7 и 9) 7. Свиной грипп а/н 1 8. Другие инфекционные заболевания вирусного и бактериального происхождения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ ускоренной диагностики инфекционных заболеваний, включающий амплификацию ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР),отличающийся тем, что для постановки ПЦР применяют от 8 до 20 специфических праймеров.