Праймеры для одновременной дифференциальной диагностики гриппа и ринопневмонии лошадей в полимеразной цепной реакции

(51) 01 33/50 (2006.01) 12 1/68 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Область техники - молекулярная диагностика инфекций, представленная полимеразной цепной реакцией. Сущность ПЦР основана на амплификации ДНК-копий специфического участка РНК вирусов и выявлении конечного продукта с помощью электрофореза в агарозном геле. Задача изобретения - разработка и получение высокоспецифичных праймеров(искусственно синтезируемых олигонуклеотидных затравок,специальных компонентов реакции),предназначенных для одновременной дифференциальной диагностики гриппа и ринопневмонии лошадей в ПЦР. Сущность изобретения заключается в конструировании и синтезировании высокоспецифичных праймеров, и достигаемый технический результат проявляется в диагностировании гриппа и ринопневмонии лошадей при постановке одной реакции, а не двух раздельных, как общепринято в настоящее время. Положительный эффект в обеспечении диагностики указанных инфекций с экономией времени и средств.(72) Карамендин Кобей Омертаевич Кыдырманов Айдын Исагалиевич Жуматов Кайнар Хамзаевич Асанова Сауле Естаевна Саятов Марат Хусаинович Даулбаева Клара Дакишевна Касымбеков Ермухаммет Торебекович Хан Елизавета Яковлевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГРИППА И РИНОПНЕВМОНИИ ЛОШАДЕЙ В ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ(57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к разработке средств одномоментной дифференциальной диагностики широкораспространенных вирусных инфекций лошадей в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Грипп и ринопневмония лошадей являются высококонтагиозными и опасными вирусными инфекциями лошадей. Они вызывают частые падежи и наносят значительный урон экономике сельского хозяйства Казахстана. Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к разработке средств одномоментной дифференциальной молекулярной диагностики широкораспространенных вирусных инфекций лошадей. Для проведения диагностики этих сходных по клиническим признакам инфекций в настоящее время используется раздельная полимеразная цепная реакция(ПЦР) с применением специфических праймеров к фрагментам внутренних белков каждого возбудителя. Известны праймеры для раздельной диагностики гриппа и ринопневмонии лошадей в ПЦР (. , 1993, 45, -.331-336.). Существенные признаки известных аналогов в том, что каждый из них в отдельности предназначен для диагностики в ПЦР гриппа лошадей ( и др.) и ринопневмонии лошадей ( . и др.). Наиболее сходным аналогом являются праймеры по и др. приготовленные для молекулярной диагностики вируса гриппа лошадей в ПЦР. Его существенный недостаток в том, что позволяет в одной реакции диагностировать только одно заболевание - грипп лошадей. В лаборатории экологии вирусов РГП Институт микробиологии и вирусологии КН МОН РК предложена мультиплексная ПЦР-диагностика вирусов гриппа и ринопневмонии лошадей в одной пробирке с помощью сконструированных праймеров к специфическим участкам нуклеиновых кислот этих возбудителей. Разработанные праймеры при совместной работе в одной реакции позволяют одновременно диагностировать два описанных заболевания - грипп и ринопневмонию лошадей. Следовательно,изобретенные праймеры позволяют в два раза сократить время на диагностику этих заболеваний и расходы на дорогостоящие реагенты. До настоящего времени подобные праймеры для одновременной идентификации возбудителей этих двух массовых инфекций лошадей в ПЦР не применялись. Задачей изобретения явилось разработка и получение высокоспецифичных праймеров,предназначенных для одновременной дифференциальной ПЦР-диагностики гриппа и ринопневмонии лошадей. Сущность изобретения заключается в том, что разработанные и синтезированные праймеры позволяют диагностировать гриппа и ринопневмонию лошадей в одной реакции, а не отдельно, как общепринято в настоящее время. 2 Отличительными признаками изобретения является совместное применение высокоспецифичных праймеров к консервативным фрагментам последовательностей нуклеиновых кислот вирусов гриппа и ринопневмонии лошадей,что существенно сокращает время, оптимизирует их идентификацию в биологических образцах и позволяет диагностировать как раздельные, так и смешанные инфекции в одной реакции. На предварительном этапе на автоматическом 96-капиллярном секвенаторе 37301) проведено секвенирование комплементарных ДНК казахстанских изолятов гриппа лошадей с использованием терминирующих дидеоксинуклеотидов. Их выравнивание с полными нуклеотидными последовательностями генов вирусов гриппа лошадей из международной базы данных проводили с помощью компьютерной программы 5.0, в результате которого были выявлены консервативные участки матриксного гена вируса гриппа лошадей также при выравнивании выявлены консервативные фрагментыгена вируса ринопневмонии лошадей для дальнейшего конструирования ПЦР-праймеров. Конструирование праймеров осуществляли следующий образом после выравнивания секвенированных фрагментов М гена вирусов гриппа лошадей игена вируса ринопневмонии лошадей с полными нуклеотидными последовательностями генов соответствующих вирусов были выявлены консервативные участки и на их основе построены консенсусные последовательности. При конструировании соблюдались следующие параметры длина праймеров 18-22 п.н.о., процентное содержаниепар - 40-60, отсутствие залипания праймеров на самих себя и образования димеров, температура плавления в пределах 55-58 С, иметь разные молекулярные массы для дифференцировки продуктов ПЦР с вирусами гриппа и ринопневмонии лошадей в агарозном геле. Результаты данного этапа показаны на фиг.1 А и В. Черным выделены сайты отжига праймеров. Пример 1. Проведены эксперименты по тестированию всех сконструированных в лаборатории экологии вирусов праймеров к фрагментам консервативной последовательности М гена вирусов гриппа лошадей игена вируса ринопневмонии лошадей, которые охватывают участки геномов в 244 и 517 пар оснований,соответственно, при различных температурновременных режимах. ПЦР проведена с одновременным использованием в одной реакции праймеров в установленной опытным путем концентрации 0,5 микромоль при одинаковых условиях ПЦР с изолятом А/лошадь/Алматы/26/07(38) и вакцинным штаммом вируса ринопневмонии лошадей СВ/69. ПЦР проводили в термоциклерепри следующих условиях начальная 2 мин денатурация при 94 С и амплификация в 30 циклов,включающая денатурацию (94 С, 30 сек), отжиг праймеров (56 С,30 сек) и удлинение цепи (72 С, 30 сек) с последующей окончательной элонгацией при 72 С,10 мин. На фиг.2 представлены результаты реакции с праймерами к участкам М гена вирусов гриппа лошадей игена вируса ринопневмонии лошадей при температуре отжига 56 С с обнаружением специфических продуктов в 132 и 517 пар оснований. Пример 2. Набор испытан с десятикратными последовательными разведениями ДНК до 10-6 разведения. Начальная концентрация специфической кДНК вируса гриппа А/лошадь/Алматы/26/07 (38) в разведении 10-1 составила 0,77 мкг/мкл, начальная концентрация ДНК вируса ринопневмонии лошадей СВ/69 в разведении 10-1 составила 0,22 мкг/мкл. ПЦР ставили с набором(Германия) со всеми последовательными разведениями ДНК. Результаты отражены на фиг.3. Как видно из рисунка 3, отдельно с кДНК вируса гриппа А/лошадь/Алматы/26/07 (38) набор работает до разведения 10-6, что составляет 77 пг/мкл, с ДНК вируса ринопневмонии лошадейдо разведения 10-5 (25 пг/мкл), в мультиплекс ПЦР также до разведения 10-5, это сопоставимо с максимально предъявляемыми требованиями к чувствительности ПЦР. Проведенные исследования показали эффективность использования сконструированных праймеров для одновременной дифференциальной диагностики гриппа и ринопневмонии лошадей в ПЦР. Предлагаемые праймеры,обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность диагностики возбудителей указанных инфекций с экономией времени и средств, рекомендуются для использования в лабораториях ветеринарного профиля. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Применение высокоспецифичные праймеры для одновременной дифференциальной диагностики гриппа и ринопневмонии лошадей в полимеразной цепной реакции.