Способ диагностики гриппа птиц методом обратно-траскриптазной ПЦР

(51) 61 39/145 (2010.01) 12 15/10 (2010.01) 01 33/53 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГРИППА ПТИЦ МЕТОДОМ ОБРАТНОТРАСКРИПТАЗНОЙ ПЦР(57) Изобретение относится к области вирусологии,точнее - к ветеринарной вирусологии и молекулярной диагностике, и касается способа выявления возбудителя гриппа птиц. Способ осуществляется путем постановки полимеразной цепной реакции, при которой с использованием синтезированных специфических праймеров выявляют РНК вируса гриппа птиц. Способ позволяет обнаруживать РНК вируса ИЛТ с довольно высокой степенью точности в короткие сроки, что позволяет диагностировать данную инфекцию за 5 часов.(72) Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич Зайцев Валентин Лукьянович Жолдыбаева Елена Витальевна Строчков Виталий Михайлович Султанкулова Куляйсан Турлыбаевна Мамадалиев Сейдигапбар Мамадалиевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан Изобретение относится к области вирусологии,точнее - к ветеринарной вирусологии и молекулярной диагностике, и касается способа выявления возбудителя гриппа птиц. Известен способ идентификации и субтипирования гриппа птиц с помощью метода обратно-траскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). При известном способе, как и в предложенном, предварительно выделяют РНК вируса гриппа птиц. Далее проводят синтез к ДНК с помощью реакции обратной транскрипции и полимеразную цепную реакцию. Однако в известном способе используют праймеры, которые синтезируют на консервативный участок другого гена. В известном способе праймеры комплементарны к области гена. Используемые в известном способе специфические праймеры имеют другие последовательности-31 (обратный). Продукт,образующийся в результате амплификации, составляет 350 п.о. (пар оснований). Нарабатывают к ДНК вируса гриппа птиц при 42 С в течение 45 мин. Амплификацию проводят при температурно-временном режиме денатурация при 95 С в течение 30 сек, отжиг при 55 С в течение 40 сек, элонгация при 72 С - 40 сек в течение 35 циклов. Детектируют продукты амплификации с помощью электрофореза в агарозном геле. Недостатком данного способа является то, что для работы специфических праймеров и наработки ПЦР-продукта необходим длительный температурно-временной режим, который значительно увеличивает время проведения исследований и тем самым постановку диагноза.-// . . . 2001.- .-97.- . 1322). Задачей является конструирование специфических праймеров и подбор температурновременных условий, позволяющих сократить время проведения анализа методом обратнотранскриптазной ПЦР. Технический результат Способ диагностики гриппа птиц высокочувствительным и специфичным методом ОТ-ПЦР позволяет точно и очень быстро (до 5 часов) выявлять РНК вируса гриппа птиц с разными клиническими симптомами болезни,при смешанных инфекциях. При этом возможно одновременное исследование большого количества проб. Предлагаемый способ диагностики предусматривает выделение вирусной РНК, синтез праймеров, постановку ОТ и ПЦР, проведение электрофореза в агарозном геле и анализ полученных электрофореграмм. Выделение РНК из органно-тканевых материалов птиц Из образцов исследуемого биологического материала готовят 20 суспензию (вес/объм). 1. К 100 мкл вируссодержащей суспензии добавляют 100 мкл раствора 1, 520). 2. Тщательно перемешают и оставляют на 10 мин при комнатной температуре, затем на 1 ч при 4 С. 3. Центрифугируют при 10000 в течение 10 мин. 4. К осадку добавляют холодного 500 мкл раствора 2 (2 М гуанидин гидрохлорида, 150 мМрН 6.0, 200 ), ресуспендируют вортексом в течение 5 сек. 5. Центрифугируют 10000 в течение 10 мин. Супернатант удаляют. 6. К осадку добавляют 500 мкл трис-буфера (150 мкл - 20- , рН 8.0, 200) и 350 мкл 96 спирта, ресуспендируют вортексом в течение 5 сек. 7. Центрифугируют при 10000 10 мин. Супернатант удаляют. 8. К осадку добавляют 500 мкл 70 спирта. Центрифугируют при 1000010 мин. 9. Удаляют супернатант и сушат при 55 С 5 мин. 10. К осадку добавляют 50 мкл воды свободной от РНК-азы и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Олигонуклеотидные праймеры Используя компьютерные пакетные программы конструируют специфические праймеры. Данные праймеры ограничивают участок ДНК размером 170 п.о. Праймеры к кДНК-последовательности вируса гриппа птиц, синтезируют на синтезаторе олигонуклеотидов. Полученные олигонуклеотиды элюируют с колонок концентрированным раствором аммиака и выпаривают в вакуумном испарителе. Преципитат праймеров растворяют в ТЕ буфере и переосаждают этанолом,ресуспендируют в деионизированнои воде и хранят при минус 20 С. Полученные таким образом синтезированные праймера разбавляют до концентрации 20 пкмоль и в дальнейшем их используют для постановки ПЦР. Реакция обратной транскрипции На первом этапе проводят синтез к ДНК на РНК вируса гриппа птиц с использованием универсального праймера 12, нуклеотидная последовательность которого комплементарна на все сегменты генома. Для синтеза к ДНК реакционная смесь состоит из следующих компонентов Вода- 4 мкл Для синтеза к ДНК пробирку помещают в термостат с температурой 42 С и инкубируют в течение 60 мин. 2 Полученная таким образом к ДНК вируса гриппа птиц используют в полимеразной цепной реакции для обнаружения возбудителя вируса гриппа птиц. Проведение ПЦР При идентификации вируса гриппа птиц готовят реакционную смесь состоящей из Вода-1 мкл. Наработку специфических участков ДНК проводят в термоциклере. Электрофоретический анализ продуктов амплификации ДНК Электрофорез продуктов амплификации ДНК вируса гриппа птиц проводят в аппарате для горизонтального электрофореза при напряжении 8 В/см. Для электрофореза используют 2 (в/о) раствор агарозы в трис-боратном буфере (ТВЕбуфере). Визуализацию ДНК проводят в УФ-свете. Документирование полученных результатов проводят при помощи фотографирования гелей в УФ-свете. Фиг. 1 демонстрирует конечный результат предлагаемого способа диагностики. Электрофореграмма продуктов амплификации при использовании праймеров 659 и М 807 на М-ген М - маркер(Н 2 О),2-РНК вируса гриппа птиц шт. А/крачка/Южная Африка/1/59 (53), 3 - РНК вируса гриппа птиц шт. Росток, 4,6 - РНК вируса гриппа птиц шт. А/домашний гусь/Павлодар/05/1(51), 5 - РНК вируса болезни Ньюкасла Пример В работе использовали следующие штаммы вирусов- органно-тканевой материал трахея, легкие, мозг, печень от павших диких уток, домашних гусей, кур из Павлодарской,Мангыстауской областях 2005 г. Выделение РНК из органно-тканевых материалов птиц Образцы исследуемого биологического материала (гортань, трахея, легкие, мозг) мелко нарезают с помощью скальпеля и помещают в ступки с песком. Материал растирают до образования однородной массы, и добавляют физиологический раствор для получения 20 суспензии (вес/объм). 1. К 100 мкл вируссодержащей суспензии добавляют 100 мкл раствора 1(4 М гуанидинизотиоцианат, 300 мМрН 6.0,400 , 520),2. Тщательно перемешают и оставляют на 10 мин при комнатной температуре, затем на 1 ч при 4 С. 3. Центрифугируют при 10000 в течение 10 мин. 4. К осадку добавляют холодного 500 мкл раствора 2 (2 М гуанидин гидрохлорида, 150 мМрН 6.0, 200 ), ресуспендируют вортексом в течение 5 сек. 5. Центрифугируют 10000 в течение 10 мин. Супернатант удаляют. 6. К осадку добавляют 500 мкл трис-буфера(150 мкл - 20- , рН 8.0, 200 ) и 350 мкл 96 спирта, ресуспендируют вортексом в течение 5 сек. 7. Центрифугируют при 10000 10 мин. Супернатант удаляют. 8. К осадку добавляют 500 мкл 70 спирта. Центрифугируют при 10000 10 мин. 9. Удаляют супернатант и сушат при 55 С 5 мин. 10. К осадку добавляют 50 мкл воды свободной от РНК-азы и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Олигонуклеотидные праймеры Используя компьютерные пакетные программыМАХ 1.0, конструируют специфические праймеры 659 и 807. Длина праймеров составляет 22 нуклеотида. Данные праймеры ограничивают участок кДНК размером 170 п.о. Праймеры к кДНК-последовательности вируса гриппа птиц, синтезируют на синтезаторе олигонуклеотидов ЕхресШе 8900. Полученные олигонуклеотиды элюируют с колонок концентрированным раствором аммиака и выпаривают в вакуумном испарителе, . Преципитат праймеров растворяют в ТЕ буфере и переосаждают этанолом, ресуспендируют в дистиллированной воде и хранят при - 20 С. Полученные таким образом синтезированные праймера используют для постановки ПЦР. Реакция обратной транскрипции На первом этапе проводят синтез к ДНК на РНК вируса гриппа птиц с использованием универсального праймера 12, нуклеотидная последовательность которого комплементарна на все сегменты генома. Для синтеза кДНК реакционная смесь состояла из следующих компонентов Вода- 4 мкл Для синтеза кДНК пробирку помещают в термостат с температурой 42 С и инкубируют в течение 60 мин. 3 Проведение ПЦР В работе используют следующие праймеры М 659 -807 - САА Готовят реакционную смесь состоящей из Вода-11.5 мкл ПЦР буфер 10 х-1 мкл Режим времени и температуры, используемый при амплификации 94 С - 3 мин - денатурация ДНК 94 С - 20 сек 55 С-20 сек 40 циклов 68 С- 20 сек 68 С - 10 мин - пострепликация ДНК Наработку специфических участков ДНК проводят в термоциклере 9700, . Электрофоретический анализ продуктов амплификации ДНК. Электрофорез продуктов амплификации ДНК вируса гриппа птиц проводят в аппарате для горизонтального электрофореза-100,фирмы , при напряжении 8 В/см. Для электрофореза используют 2 (в/о) раствор агарозы в трис-боратном буфере(ТВЕ-буфере). Визуализацию ДНК проводят в УФ-свете с длиной волны 254 нм,на приборе. Документирование полученных результатов проводят при помощи фотографирования гелей в УФ-свете,с использованием оранжевого светофильтра на цифровую фотокамеру. В качестве маркера молекулярных масс используют маркер-, 50-10000 , фирмыФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики гриппа птиц, при котором выделяют РНК, проводят обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию, с последующим электрофорезом в агарозном геле, отличающийся тем, что используют специфические праймеры,имеющие нуклеотидные последовательности 659