Способ получения специфической сыворотки к вирусу гриппа птиц типа А

(51) 61 39/145 (2010.01) 61 39/395 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области биотехнологии, точнее, к лабораторной диагностике инфекционных заболеваний птиц и может быть использовано для эффективного получения специфических сывороток против мембранного белка вируса гриппа птиц типа А. Способ получения специфической сыворотки к вирусу гриппа птиц типа А включает иммунизацию доноров белками вируса гриппа птиц типа А, взятие крови и отделение сыворотки, при этом в качестве доноров используют коз, которых иммунизируют очищенным мембранным белком вируса гриппа птиц типа А пятикратно, в возрастающей дозе, с интервалом между введениями в 2-3 недели, причем при 2-3 введении используют смесь мембранного белка с сапонином, а при 4 введении - с гидроксалом. Способ получения специфической сыворотки позволяет получить специфичную и активную сыворотку на козах для постановки ИФА при типировании антигена и антител вируса гриппа птиц типа А.(72) Кошеметов Жумагали Каукарбаевич Матвеева Валентина Михайловна Ажибаев Азамат Жасуланович Нурабаев Сергазы Шуратбаевич Катубаева Бибигуль Сериковна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Яхно М.А., Ямникова С.С., Закстельская Л.Я. Эффективные методы получения антисывороток к гемагглютинину НЗ//Вопросы вирусологии,- 1978 4 - с. 498-5011740416 А 1, 19921818342 1, 199310637 А, 20016855315 2, 2005(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ К ВИРУСУ ГРИППА ПТИЦ ТИПА А Изобретение относится к области биотехнологии, точнее, к лабораторной диагностике инфекционных заболеваний птиц. Есть литературные данные о том, что специфические сыворотки на различные штаммы вируса гриппа получены на кроликах М.А. Яхно,С.С. Ямникова, Л.Я. Закстельская. Эффективные методы получения антисывороток к гемагглютинину НЗ. Вопросы вирусологии. - 1978.4. - с. 498-501. Как описано в этом источнике,для получения антисывороток к НЗ вируса гриппа птиц типа А кролику непосредственно в оба подколенных лимфатических узла вводили 0,1 мл антигена с адъювантом Фрейнда. Через месяц повторно инъецировали антиген в том же количестве, но без адъюванта. Однако антиген разводили в большем количестве физиологического раствора, поскольку его вводили кроликам внутривенно (0,2 мл), внутримышечно (передняя лапа 0,4 мл) и в область одного из подколенных лимфатических узлов (0,4 мл). Кровь у кроликов брали из краевой вены уха через 10-14 дней после иммунизации. На весь курс иммунизации на каждого кролика было затрачено около 500-600 мкг. Активность полученных сывороток в РТГА составила 15120 Однако недостаток данной схемы получения сывороток крови на кроликах к НЗ вируса гриппа птиц типа А высокая неспецифичность фоновый уровень при постановке лабораторных тест-систем кроме РТГА. Задача изобретения - разработка оптимальной схемы получения активной специфической сыворотки к матричному белку (МБ) вируса гриппа птиц (ВГП) типа А, пригодной для применения в серологических тестах с использованием в качестве донора коз, а в качестве адъювантов сапонина и гидроокись алюминия. Разработанный способ осуществляют в следующей последовательности Приготовление очищенного вирусного концентрата Вируссодержащую суспензию осветляли центрифугированием при 9000 об/мин,обрабатывали антибиотиками в дозе 1000-2000 ЕД/мл. Затем в суспензию добавляли 5 свежевзятых и отмытых эритроцитов козы. Адсорбция вируса на эритроцитах длилась в течение 1 ч при 4 С. Эритроциты осаждали при 2000 об/мин в течение 15 мин. Нагруженные вирусом эритроциты однократно отмывали холодным физиологическим раствором в течение 15 мин при 2000 об/мин. Элюцию вируса с эритроцитов проводили подогретым физиологическим раствором, добавляя его к эритроцитам в объме 1/10 от исходного, при температуре 37 С в течение Вид животного 4-6 ч. Вирус отделяли от эритроцитов в том же режиме. Активность выделенного вируса определяли в РГА по общепринятой методике. Далее вирус осаждали при 30000 об/мин в течение 90 мин и очищали в градиенте плотности 30 сахарозы. Очищенный вирус ресуспендировали в 100-кратном объме стерильного 0,05 М фосфатнобуферного раствора с рН 7,2-7,4. В очищенном препарате вируса определяли содержание белка,гемагглютинирующую активность и исследовали с целью контроля чистоты и нативности препаратов вируса в электронном микроскопе 100 В. Выделение МБ Очищенный вирус (700-800 мкг белка) смешивали с 1 М раствором хлористого калия,содержащим 10 тритона Х-100, в соотношении 14 по объему. Затем смесь периодически встряхивали в течение 1 ч на магнитной мешалке и центрифугировали при 27000 об/мин в течение 45 мин. Надосадочную жидкость собирали и диализовали против 0,01 М ФБР с рН 7,2 в течение ночи при 4 С на магнитной мешалке. После диализа жидкость центрифугировали при 8000 об/мин в течение 25 мин. Образовавшийся осадок (МБ) ресуспендировали в 0,05 М ФБР до необходимой концентрации и использовали для гипериммунизации животных. Схема получения антисыворотки Специфическую антисыворотку к МБ ВГП типа А получали на козах местных пород. Для этого козам вводили очищенные препараты МБ по следующей схеме гипериммунизации. Схема гипериммунизации коз состояла из пяти введений очищенного препарата белка М ВГП в возрастающей дозе в область предлопаточных лимфоузлов с интервалом между введениями в 2-3 недели в комплексе с сапонином (2 и 3 введение) и ГОА (4 введение). Через 14 суток после последнего введения вируса коз тотально обескровливали и полученную сыворотку отстаивали в термостате при 37 С. Отстоявшуюся сыворотку осветляли центрифугированием при 2000 об/мин в течение 30 мин и исследовали в серологических тестах. Приготовленная по данной схеме сыворотка активна, специфична и пригодна для приготовления антительный диагностикумов для ИФА. Полученную специфическую сыворотку против мембранного белка вируса гриппа птиц типа А применяют для лабораторной диагностики и типирования ВГП типа А в различных испытуемых материалах. Разработанная схема получения специфической сыворотки против МБ ВГП типа А Концентрация Конечная вводимого белка концентрация мкг/см 3 вводимого адъюванта в Подкожно, в область предлопаточных лимфатических узлов ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения специфической сыворотки к вирусу гриппа птиц типа А, включающий иммунизацию доноров белками вируса гриппа птиц типа А, взятие крови и отделение сыворотки,отличающийся тем, что в качестве доноров используют коз,которых иммунизируют очищенным мембранным белком вируса гриппа птиц типа А пятикратно, в возрастающей дозе, с интервалом между введениями в 2-3 недели, причем при 2-3 введении используют смесь мембранного белка с сапонином, а при 4 введении - с гидроксалом.