Способ изготовления тест-системы для диагностики бруцеллеза животных методом иммунохроматографического анализа

(51) 61 39/40 (2006.01) 01 33/543 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ бруцеллеза крупного рогатого скота методом иммунохроматографического анализа,на нитроцеллюлозную мембрану наносят антиген,выделенный из взвеси клеток штамма В.19 экстракцией в горячем растворе хлорида натрия. Экстракт затем подвергают очистке методом гельфильтрации на сефадексе. Вместе с антигеном на мембрану наносится вторая линия (контрольная),содержащая моноклональные антитела к легкой цепи иммуноглобулинов крупного рогатого скота. На отдельную мембрану наносится конъюгат белок , меченый коллоидным золотом. Сборку теста осуществляют последовательным наклеиванием на пластиковую адгезивную подложку мембран в следующем порядке-мембрана с нанесенными тестовой и контрольной полосой,-адсорбирующуя мембрана,-мембрана с коньюгатом,-сепарирующая мембрана,-мембрана для нанесения образца. Предлагаемый способ позволяет получить более активную и специфичную иммунохроматографическую тест-систему для диагностики бруцеллеза у разных видов животных,позволяющий проводить анализ на сыворотке и на цельной крови.(72) Чунчубаев Жолымхан Калиханович Рахимбаев Серик Жумадилович Шенжанов Канат Толюбаевич Нуралин Дулат Жанахметович Кемешов Жомарт Омирбекович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Бицентр Акционерное общество Национальный научно-технологический холдинг Парасат(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ТЕСТСИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ МЕТОДОМ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения диагностикумов для проведения иммунохроматографического анализа, и может быть использовано при диагностике бруцеллеза животных. Для достижения указанной цели в способе изготовления тест-системы для диагностики Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения диагностикумов для проведения иммунохроматографического анализа, и может быть использовано при диагностике бруцеллеза животных. Известен способ изготовления иммунохроматографического теста для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота 254604,15.02.2012,включающий нитроцеллюлозную мембрану с нанесенными антигеном и контрольными антителами, мембрану с конъюгатом коллоидного золота и антибычьих антител,мембрану для нанесения образца и адсорбирующую мембрану. Недостатком этого метода получения тест-системы является невозможность ее применения для диагностики бруцеллеза у других видов животных, а также исследование цельной крови. Задачей изобретения является создание тестсистемы для диагностики бруцеллеза у разных видов животных методом иммунохроматографического анализа при исследовании сыворотки крови и цельной крови. Сущность изобретения заключается в том, что в конъюгат вместо антивидовых антител вводят рекомбинантный белок , позволяющий проводить анализ на бруцеллез у нескольких видов животных,а также введение в состав тест-полоски дополнительной фильтрующей мембраны,позволяющей использовать для анализа не только сыворотку, но и цельную кровь. Для достижения указанной задачи в способе изготовления тест-системы для диагностики бруцеллеза животных методом иммунохроматографического анализа,сенсибилизацию нитроцеллюлозной мембраны осуществляют высокоочищенным липополисахаридным антигеном из В.штамм 19 (тестовая линия) и моноклональными антителами к легкой цепи иммуноглобулинов крупного рогатого скота (контрольная линия). Мембрану подсушивают и блокируют в растворе альбуминов. В качестве выявляющего агента выступает конъюгат коллоидного золота с белком ,обладающим видовой универсальностью в отношении антител большинства млекопитающих. Конъюгат наносят на заранее блокированную раствором альбуминов мембрану и высушивают. Сборка теста осуществляется на пластиковой адгезивной положке последовательным наклеиванием нитроцеллюлозной мембраны,мембраны с конъюгатом,адсорбирующей мембраны, фильтрующей мембраны и мембраны для нанесения образца. Готовые тесты нарезают на полоски и упаковывают в фольгированные пакеты с влагопоглотителем. Пример изготовления тест-системы для диагностики бруцеллеза животных методом иммунохроматографического анализа. Приготовление липополисахаридного антигена Осадок бактериальной массы автоклавируют. После автоклавирования клетки ресуспендируют в 0,2 М растворе хлорида натрия, нагретого до 60 С. Ресуспендированные клетки выдерживают при 66 С на водяной бане в течение 3 ч. Суспензию остужают и центрифугируют при 10 000 об/мин 15 мин при 4 С. Отбирают надосадок и добавляют к нему 3 объема холодного перегнанного этанола и 1 этанола, насыщенного ацетатом натрия. Оставляют на ночь при 4 С для формирования осадка. Сформировавшийся осадок центрифугируют 10 мин при 10 000 об/мин. Супернатант отбрасывают,а осадок ресуспендируют в трис-буфере, содержащем 1 мМ ЭДТА и 0,5 дезоксихолата натрия в 15-кратном объеме к весу осадка (г/см 3). Образец ЛПС выдерживают 16 часов при 37 С. Хроматографическую колонку с сефадексом промывают дистиллированной водой. Затем колонку промывают трис-буфером, содержащим 1 мМ ЭДТА и 0,5 дезоксихолата натрия. Загружают образец ЛПС-антигена и подключают резервуар с буфером. Отбирают первую фракцию. Полученный антиген диализуют против дистиллированной воды в течение ночи при 4 С. Приготовление конъюгата Конъюгат коллоидного золота с белком) получают с использованием коммерческого набора. Нанесение реагентов на мембрану Антиген и контрольные антитела(моноклональные антитела к легкой цепиКРС) иммобилизуют путем нанесения при помощи струйно-капилярного устройства на нитроцеллюлозную мембрану. Сорбцию проводят в чистой комнате при температуре 18-22 С и относительной влажности 70-80. После нанесения антигена мембрану сушат в термостате 2 ч при температуре 37 С. Расстояние между контрольной и тестовой линией на нитроцеллюлозной мембране должно быть 5 мм. После нанесения антител мембрану сушат 2 часа при 37 С в сушильной камере. Блокировка мембраны осуществляется после нанесения антигенов и антител путем погружения в раствор бычьего,овечьего и лошадиного альбуминов. Инкубируют мембрану 60 мин при 37 С. После чего мембрану сушат 4 часа при 37 С в сушильной камере. Нанесение конъюгата на мембрану Перед нанесением коньюгата стекловолоконную мембрану блокируют раствором бычьего, овечьего и лошадиного альбуминов. Для нанесения коллоид-золотого коньюгата используется то же специальное устройство, что и для нанесения антигена, но вместо капельных распылителей применяют аэрозольный. Полученная мембрана сушится в сушильной камере при 37 С. Сборка компонентов на адгезивной подложке Сборку тестов из подготовленных компонентов осуществляют в чистом помещении при температуре 20-22 С и относительной влажности воздуха 30-40 Сборка осуществляется путем приклеивания компонентов на адгезивную подложку (карточку) в следующем порядке по центру адгезивной подложки приклеивают нитроцеллюлозную мембрану с нанесенными тестовой и контрольной полосой размером,сверху приклеивают адсорбирующую мембрану с перекрытием нитроцеллюлозной мембраны на 2 мм, снизу нитроцеллюлозной мембраны приклеивают мембрану с конъюгатом с перекрытием нитроцеллюлозной мембраны на 2 м, затем приклеивают сепарирующую мембрану с перекрытием мембраны с конъюгатом на 4 мм, в конце приклеивают мембрану для нанесения образца с перекрытием сепарирующей мембраны на 4 мм. Нарезка тест-полосок Готовая тест-карта нарезается на тест-полоски шириной 4 мм при помощи ручного резака либо специального автоматического устройства. Приготовление раствора для разведения исследуемых проб Состав раствора , КС, 2 О 4, К 2 НРО 4,додецилсульфат натрия, азид натрия, твин-20. Навески солей засыпают в мерную колбу,наливают воду и перемешивают до полного растворения.устанавливают 7,5. Проведение анализа 1. Открывают крышку микропробирки с раствором для разведения проб. В случае, если в набор предусматривает комплектацию пустыми пробирками и флаконом с раствором, из флакона в пробирку переносят 0,3 мл (10 капель) раствора.(30 мкл) исследуемого образца, аккуратно перемешать. 3. Погрузить тест-полоску в пробирку. В случае,если тест-полоска помещена в пластиковую кассету,из пробирки с разведенной пробой в окно для загрузки образца помещают 4-5 капель. 4. Наблюдать за движением фронта реагентов в течение 7-10 минут. 2.4 Учт результатов анализа. Проводят визуально или при помощи специального аппаратно-программного комплекса. Визуальный учет - при окраске двух полос(реакционной и контрольной) - результат считают позитивным. При окраске одной полосы(контрольной) - результат считают негативным. Внимание Если анализ проведен правильно,контрольная полоса должна появляться всегда, не зависимо от присутствия антител в исследуемом образце. Если же контрольная полоса отсутствует,анализ проведен некорректно. Исследование чувствительности иммунохроматографической тест-системы Для исследования на чувствительность тестировали 43 пробы положительных на бруцеллез полевых сывороток, взятых из разных источников и предварительно исследованных с помощью классических методов (РА с розбенгал антигеном и единым бруцеллезным антигеном). Результаты теста учитывали визуально по наличию тестовой полосы. Чувствительность методов определяли согласно требованиям МЭБ. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1. Таблица 1 Исследование чувствительности иммунохроматографической тест-системы Сыворотка 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Таким образом, исходя из полученных результатов, следует, что чувствительность тестсистемы составила 97,6, из исследованных проб сывороток одна проба показала отрицательный результат и одна проба - сомнительный результат. Исследование специфичности иммунохроматографической тест-системы Для исследования на специфичность тестировали 67 проб отрицательных на бруцеллез сывороток, полученных из разных источников и подтвержденных в РА с розбенгал антигеном и непрямом ИФА. Кроме того были исследованы 2 пробы сыворотки против кишечного ерсиниоза. Результаты теста учитывали визуально по наличию или отсутствию тестовой полосы. Специфичность методов определяли согласно требованиям МЭБ. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 2. Таблица 2 Исследование специфичности иммунохроматографической тест-системы Сыворотка 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Результаты, представленные в таблице 2,свидетельствуют, что специфичность тест-системы равна 100. Сравнительные испытания тест-системы с зарубежными аналогами Исследования иммунохроматографических тестсистем проводили с аналогичными тестами производства(Литва) и(Корея). Постановку анализа осуществляли согласно прилагаемым наставлениям. В опытах использовалось по 10 тест-систем каждого производителя. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 3. Таблица 3 Результаты сравнительных исследований иммунохроматографических тест-систем от разных производителей Как видно из фотографий, представленных в таблице 3, по образованию полос в результате реакции с положительными и отрицательными сыворотками заявляемый экспресс-тест и зарубежные аналоги идентичны. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ изготовления тест-системы для диагностики бруцеллеза животных методом иммунохроматографического анализа, включающий нанесение антигена бруцелл и контрольных антител на нитроцеллюлозную мембрану, конъюгата коллоидного золота на стекловолоконную мембрану и сборку всех составляющих тест-полоски на адгезивной подложке, отличающийся тем, что в составе конъюгата используют рекомбинантный белок , позволяющий проводить диагностику у нескольких видов животных и дополнительно используют фильтрующую мембрану,позволяющую проводить анализ на цельной крови.