Способ изготовления тест-системы для диагностики бруцеллеза животных методом конкурентного иммуноферментного анализа

(51) 61 39/40 (2006.01) 01 33/535 (2006.01) 01 33/543 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Для достижения указанной цели в способе изготовления тест-системы для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота методом конкурентного иммуноферментного анализа,сенсибилизацию полистироловых планшет осуществляют антигеном, выделенным из взвеси клеток штамма В.19 экстракцией в горячем растворе хлорида натрия. Экстракт затем подвергают очистке методом гель-фильтрации на сефадексе. Планшеты с внесенным антигеном инкубируют в холодильнике. После инкубации содержимое лунок удаляют, планшеты высушивают и упаковывают в полиэтиленовые фольгированные пакеты под вакуумом. Конъюгат для данной тест-системы получают путем сшивания пероксидазы хрена и моноклональных антител против О-цепи липополисахарида бруцелл методом периодатного окисления. Предлагаемый способ позволяет получить более активную и специфичную конкурентную иммуноферментную тест-систему для диагностики бруцеллеза животных.(72) Чунчубаев Жолымхан Калиханович Рахимбаев Серик Жумадилович Шенжанов Канат Толюбаевич Нуралин Дулат Жанахметович Кемешов Жомарт Омирбекович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Бицентр Акционерное общество Национальный научно-технологический холдинг Парасат(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ТЕСТСИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ МЕТОДОМ КОНКУРЕНТНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения диагностикумов для проведения конкурентного иммуноферментного анализа, и может быть использовано при диагностике бруцеллеза животных. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения диагностикумов для проведения иммуноферментного анализа, и может быть использовано при диагностике бруцеллеза животных. Известен способ изготовления конкурентной тест-системы для диагностики бруцеллеза методом ИФА ( КН, ,. 1995 46(3-4)285-91). Способ подразумевает использование липополисахаридного антигена в основе твердой фазы, моноклональных антител к Оучастку липополисахарида бруцелл в качестве конкурирующих антител и козьих антимышиных антител в качестве детектирующего компонента. Недостатком этого метода получения тестсистемы является использование двух видов антител, что влечет за собой удорожание анализа и увеличение времени анализа. Известен способ получения конкурентной тестсистемы для диагностики бруцеллеза методом иммуноферментного анализа,включающий неспецифическую адсорбцию моноклональных антител мыши к -ЛПС и -ЛПС бруцеллезным антигенам,и второй специфическое иммунологическое связывание -ЛПС и -ЛПС антигенов с моноклональными антителами мыши к этим антигенам, далее вносят и инкубируют испытуемый материал вместе с меченными ферментом моноклональными антителами, после инкубации отмывают несвязавшиеся реагенты,добавляют субстрат ферментативной реакции для выявления связавшихся антител и определяют наличие антител к бруцеллезным антигенам по величине оптической плотности испытуемых образцов (Росс. патент 2490647). Недостатком этого метода получения тестсистемы является сложность получения твердой фазы, а также использование дополнительного количества моноклональных антител,что дополнительно влечет за собой удорожание анализа. Целью изобретения является создание тестсистемы для диагностики бруцеллеза животных методом конкурентного иммуноферментного анализа, более простой в изготовлении, требующей проведение меньшего количества операций при постановке анализа и обладающей достаточно высокой активностью и специфичностью. Для достижения указанной цели в способе изготовления тест-системы для диагностики бруцеллеза животных методом конкурентного иммуноферментного анализа,сенсибилизацию полистиролового плоскодонного планшета осуществляют высокоочищенным липополисахаридным антигеном из В.штамм 19. Планшеты оставляют в холодильнике при температуре 4 С на 18-20 ч. После инкубации содержимое лунок удаляют, планшеты высушивают и упаковывают в фольгированные полиэтиленовые пакеты под вакуумом. Иммунопероксидазный конъюгат готовят периодатным методом. Для этого окисленную периодатом натрия пероксидазу хрена смешивают с моноклональными антителами против О-цепи 2 липополисахарида бруцелл, останавливают реакцию боргидридом натрия, диализуют и смешивают со стабилизирующим раствором. Положительный контроль получают иммунизацией животных взвесью бруцелл либо очищенным липополисахаридом. Отрицательный контроль получают от здоровых животных, не имеющих антител против бруцелл. Полученные контроли консервируют и фасуют в микропробирки. Пример изготовления тест-системы для диагностики бруцеллеза животных методом конкурентного иммуноферментного анализа. Приготовление липополисахаридного антигена Осадок бактериальной массы автоклавируют в режиме 1 атм 45 мин. После автоклавирования клетки ресуспендируют в 0,2 М растворе хлорида натрия, нагретого до 60 С. Ресуспендированные клетки выдерживают при 66 С на водяной бане в течение 3 ч. Суспензию остужают и центрифугируют при 10 000 об/мин 15 мин при 4 С. Отбирают надосадок и добавляют к нему 3 объема холодного перегнанного этанола и 1 этанола, насыщенного ацетатом натрия. Оставляют на ночь при 4 С для формирования осадка. Сформировавшийся осадок центрифугируют 10 мин при 10 000 об/мин. Супернатант отбрасывают,а осадок ресуспендируют в трис-буфере, содержащем 1 мМ ЭДТА и 0,5 дезоксихолата натрия в 15-кратном объеме к весу осадка (г/см 3). Образец ЛПС выдерживают 16 часов при 37 С. Хроматографическую колонку с сефадексом промывают дистиллированной водой, пропуская через нее 10 объемов. Затем колонку промывают 3-мя объемами трис-буфера, содержащего 1 мМ ЭДТА и 0,5 дезоксихолата натрия. Загружают образец ЛПС-антигена и подключают резервуар с буфером. Отбирают первую фракцию. Полученный антиген диализуют против дистиллированной воды в течение ночи при 4 С. Специфичность и чувствительность полученной фракции антигена контролируют в непрямом ИФА с использованием внутрипроизводственной панели сывороток. Антиген разводят до нужной концентрации раствором для сенсибилизации и вносят в лунки планшет. Сорбцию проводят в холодильнике при температуре 4 С. Приготовление пероксидазного конъюгата Моноклональные антитела против О-цепи липополисахарида бруцелл диализируют против карбонат-бикарбонатного буфера (КББ) 0,01 М 10,8. Навеску пероксидазы растворяют в 500 мкл буфера 3 0,1 М 6,5 и добавляют 500 мкл 0,01 М 4. Ставят на шейкер на 5 часов при комнатной температуре после чего добавляют диализированные моноклональные антитела с концентрацией в 2 раза меньшей от концентрации пероксидазы. Смесь наносят на колонку с сефадексом. Выдерживают 15 мин при комнатной температуре в колонке и эллюируют Трис- с 8. Добавляют боргидрид натрия и оставляют на 30 мин при 4 С. Диализируют против фосфатного буфера ночь при комнатной температуре. Проведение ИФА Перед началом работы компоненты набора необходимо выдержать при температуре 18-22 С в течении 30 минут. 1) Иммуносорбент освобождают от упаковки. 2) В каждую лунку вносят по 0,045 см 3 раствора для промывки планшета. 3) В лунки вносят по 0,005 см 3 образцов исследуемых сывороток, оставляя свободными первые 4 лунки первого ряда (лунки для контролей). 4) В 2 лунки (1, В 1) вносят по 0,005 см 3 позитивного контроля (К), а в 2 следующие (1,1) - по 0,005 см 3 негативного контроля (К-). 5) В лунки вносят по 0,05 см 3 раствора конъюгата. 6) Заклеивают планшет плнкой и инкубируют при температуре 37 С 60 минут. 7) По окончании инкубации удаляют содержимое из лунок с помощью промывателя или 8-канальной пипетки и промывают лунки три раза раствором для промывки планшет по 0,35 см 3, после чего избавляются от лишней влаги, постукивая планшетом по фильтровальной бумаге. 8) Вносят в лунки планшета по 0,1 см 3 раствора хромогена (ТМБ). 9) Инкубируют планшет при температуре 1825 С в темном месте 20 минут. 10) Останавливают цветную реакцию внесением во все лунки по 0,05 см 3 раствора стоп-реагента. 11) Не более чем через 3 минуты после остановки цветной реакции, на фотометре,определяют оптическую плотность (ОП) раствора в лунках на длине волны света 450 нм против 620 нм. Учт результатов анализа 1) Рассчитывают среднее значение оптической плотности (ОП) для лунок негативного контроля(ОП К-) и для позитивного контроля (ОП К). Проведение анализа считается корректным, если среднее значение ОП К- не ниже 1,6 оптической единицы (ОЕ), а среднее значение ОП К не выше 0,1 ОЕ. Если одно из двух значений ОП К- ниже 1,6 ОЕ его не учитывают и для дальнейших расчетов используют оставшееся значение ОП К-. 2) Граничное значение ОП (ГЗ) ГЗ рассчитывают, отнимая от среднего значения ОП К- константную величину (например 1,5). Результаты анализа считаются позитивными,если значения ОП исследуемого образца меньше ГЗ. 3) Результаты анализа считаются негативными,если значения ОП исследуемого образца больше ГЗ. Исследование чувствительности конкурентной иммуноферментной тест-системы Для исследования на чувствительность тестировали 43 пробы положительных на бруцеллез полевых сывороток, взятых из разных источников и предварительно исследованных с помощью классических методов (РА с розбенгал антигеном и единым бруцеллезным антигеном). Результаты конкурентного ИФА учитывались в виде среднего арифметического значения оптической плотности(ОП). Чувствительность метода определяли согласно требованиям МЭБ. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1. Таблица 1 Исследование чувствительности изготовленных опытных образцов конкурентной иммуноферментной и иммунохроматографической тест-систем Сыворотка 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 конкурентной ИФА тест-системы составляет 100 все исследованные положительные пробы 3 сывороток показали положительный результат в конкурентном ИФА. Исследование специфичности конкурентной иммуноферментной тест-системы Для исследования на специфичность тестировали 67 проб отрицательных на бруцеллез сывороток,полученных из разных источников и подтвержденных в РА с розбенгал антигеном и непрямом ИФА. Кроме того были исследованы 2 пробы сыворотки против кишечного ерсиниоза. Результаты конкурентного ИФА учитывались в виде среднего арифметического значения ОП. Специфичность метода определяли согласно требованиям МЭБ. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 2. Таблица 2 Исследование специфичности изготовленных опытных образцов конкурентной иммуноферментной и иммунохроматографической тест-систем Сыворотка 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Результаты, представленные в таблице 2,свидетельствуют, что специфичность конкурентной тест-системы равна 100. Сравнительные испытания конкурентной тестсистемы с зарубежными аналогами Исследование соответствия разработанной конкурентной тест-системы зарубежным аналогам проводили с использованием 83 образцов сывороток различной специфичности. Для сравнения использовали тест-систему- производства Швеция. Исследуемые пробы сывороток были параллельно проверены в непрямом ИФА на тест-системе нашего производства. Полученные результаты представлены в таблице 3. Таблица 3 Сравнительные исследования опытного образца конкурентной тест-системы с зарубежным аналогом- Сыворотка 2 3 4 5 11 13 20 21 30 31 37 39 40 45 47 57 63 66 Примечание- положительный результат - - отрицательный результат. Из результатов, представленных в таблице 3,следует, что конкурентная иммуноферментная тестсистема по своим характеристикам соответствует зарубежному аналогу- . При этом из всех исследованных образцов сывороток 6 показали положительный результат в непрямом ИФА и отрицательный в обоих конкурентных тест-системах, 4 образца были отрицательными в непрямом ИФА и положительными в обоих конкурентных тестсистемах. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ изготовления тест-системы для диагностики бруцеллеза животных методом конкурентного иммуноферментного анализа,включающий сенсибилизацию полистироловых планшет высокоочищенным липополисахаридным антигеном, отличающийся тем, что используют штамм В 19, полученный путем горячей солевой экстракции из клеток с последующей очисткой гель-фильтрацией, при этом конъюгат для тест-системы получают периодатным методом, путем сшивания пероксидазы хрена с моноклональными антителами против О-цепи липополисахарида бруцелл.