Способ изготовления тест-системы для диагностики бруцеллеза животных методом иммуноферментного анализа

(51) 61 39/00 (2010.01) 61 39/10 (2010.01) 01 33/535 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ антигеном из смеси (111) ультразвуковых лизатов штаммов бруцелл 19,-1,ресуспендированных в забуференном физиологическом растворе с 7,3 (ФСБ) в концентрации 10 мкг/см 3, с последующей инкубацией при 4 в течение 18-24 часа,четырехкратным отмыванием забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,05 твина-20 (ФСБ-Т), внесением в каждую лунку по 0,1 см 3 1 раствора бычьего сывороточного альбумина на ФСБ для блокировки свободных поверхностей твердой фазы, а через 1 час после инкубации при 37 удаление содержимого лунок, отмыванием планшета вышеописанным способом,высушиванием, упаковкой в полиэтиленовый пакет и запаиванием. Предлагаемый способ позволяет получить тестсистему для диагностики бруцеллеза разных видов животных, а также повысить активность и специфичность диагностикума.(72) Иванов Николай Петрович Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Хусаинов Дамир Микдатович(56) Маматова З.Б. Иммуноферментный метод диагностики бруцеллеза. Канд. Дисс. М. 1986, с. 46106(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ТЕСТСИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения диагностикумов для проведения иммуноферментного анализа, и может быть использовано при диагностике бруцеллеза животных. Для достижения указанной цели сенсибилизацию полистироловой планшеты осуществляют Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения диагностикумов для проведения иммуноферментного анализа, и может быть использовано при диагностике бруцеллеза животных. Известен принятый за аналог способ получения тест-системы для диагностики бруцеллеза овец методом иммуноферментного анализа, включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты антигеном из штамма- 1, при этом используют корпускулярный антиген, который вносят в лунки полистироловой планшеты, в забуференном физиологическом растворе с 7,3 с оптической плотностью 0,1 о.е. мутности,устанавливаемой при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм, а сенсибилизацию полистироловой планшеты осуществляют путем е инкубации при 37 в течение 15 мин. (Маматова З.Б. Иммуноферментный метод диагностики бруцеллеза. Канд. дисс. М., 1986, С. 46-106.). Недостатком этого метода получения тестсистемы является невозможность его применения для диагностики бруцеллеза других видов животных методом иммуноферментного анализа,недостаточная активность и специфичность. Известен принятый за прототип способ получения тест-системы для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа,включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты антигеном из штамма 19, при этом используют корпускулярный антиген, который вносят в лунки полистироловой планшеты, в забуференном физиологическом растворе с 7,3 с оптической плотностью 0,1 о.е. мутности,устанавливаемой при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм, а сенсибилизацию полистироловой планшеты осуществляют путем е инкубации при 37 в течение 15 мин. (Маматова З.Б. Иммуноферментный метод диагностики бруцеллеза. Канд. дисс. М., 1986, с. 46-106.). Недостатком этого метода получения тестсистемы является невозможность его применения для диагностики бруцеллеза других видов животных методом иммуноферментного анализа,недостаточная активность и специфичность. Целью изобретения является создание единой тест-системы для диагностики бруцеллеза разных видов животных, а также повышение активности и специфичности диагностикума. Для достижения указанной цели в способе изготовления тест-системы для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа,сенсибилизацию полистироловой планшеты осуществляют смесью ультразвуковых лизатов бруцелл из штаммов 19,82 и- 1 (соотношение 111), имеющих в антигенной структуре - -,и детерминантные группы,в забуференном физиологическом растворе с 7,3 (ФСБ) в концентрации 10 мкг/см. Затем планшет накрывают крышкой и оставляют в холодильнике 4 на 18-24 2 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют,планшет отмывают четырехкратно забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,05 твина-20 (ФСБ-Т), и в каждую лунку вносят по 0,1 см 3 1 раствора бычьего сывороточного альбумина на ФСБ для блокировки свободных поверхностей твердой фазы. Через 1 час после инкубации при 37 содержимое лунок удаляют, планшет отмывают вышеописанным способом, высушивают,упаковывают в полиэтиленовый пакет и запаивают. Пример изготовления тест-системы для диагностики бруцеллеза животных методом иммуноферментного анализа. 1 Приготовление матровой расплодки. Для изготовления серии бруцелл в качестве посевного материала используют сухие эталонные культуры вакцинных штаммов 19,82 и- 1. Для получения посевного материала в ампулу с сухой или косяк агара культурой штамма наливают стерильный физиологический раствор до первоначального объема. После полного суспендирования микробной массы готовят 10 кратные разведения в пробирках до 10-7-10-9, в которые перед разведением разливают стерильный физиологический раствор в количестве 4,5 см. Из двух последних разведений производят высевы по 0,1 см 3 на 3-5 чашек Петри с питательным агаром. Чашки с агаром перед засевом предварительно подсушивают в термостате при 37-38 в течение 24 часов. Микробную взвесь, засеянную на чашки,равномерно распределяют по поверхности агара и выдерживают в термостате при 37-38 в течение 46 суток. Посевы просматривают на чистоту и типичность роста колоний. Из чашек отбирают типичные колонии, которые отсевают на пробирки с одной из названных питательных сред. Выращенная в течение 2-3 суток при 37- 38 культура является исходным посевным материалом, для засева производственных серий бруцеллезной вакцины. Эту рабочую культуру хранят на агаре в пробирках не более 5 недель при температуре 2-4 С. 2 Засев взвеси бруцелл на колбы (четверти,ферментеры). Для засева серии бруцелл двухсуточную культуру вакцинного штамма каждого вида смывают физиологическим раствором или 1-ой глюкозой и сливают в емкость,наполненную одним из названных растворов из расчета получения 2-5 млрд-ной взвеси микробных клеток в 1,0 см 3 по оптическому стандарту мутности. Для получения такой концентрации на 1,0 дм раствора обычно берут смыв культуры с 4-6 пробирок скошенного агара. Такой расплодкой засевают колбы(четверти) очередной производственной серии. Для посева применяют также 2-3-суточную агаровую культуру,выращенную на колбах (четвертях). В этом случае засеянные колбы Тартаковского (Ру) или четверти увлажняют посевным материалом из расчета 4,0-5,0 см 3 взвеси и помещают в термостат при 37-38 на 2-3 суток. Через 24 ч после посева поверхность агара в колбах (четвертях) увлажняют вторично для лучшего роста. Через 2 сут. после этого выращенную культуру проверяют на чистоту, типичность роста,затем смывают физиологическим раствором или 1-ой глюкозой и готовят 2-5 млрд-ную взвесь бруцелл для засева питательной среды производственной серии в колбах (четвертях) или ферментерах (из расчета 2-5 млрд бруцелл на 1,0 см 3 жидкой питательной среды). В ферментеры дополнительно добавляют пеногаситель (пропинол-Б- 400) из расчета 0,030,07 к общему объему засеянной среды. 3 Смыв культуры штаммов с колб (четвертей),слив с ферментеров. Через 3-4 суток колбы(четверти), где на питательном агаре засеяна культура вакцинного штамма, просматривают на чистоту, типичность роста и отбирают для смыва. Культуру смывают фенолизированным физиологическим раствором (25,0-30,0 см 3 на одну колбу, или четверть). Смытую с колб (четвертей) культуру отсасывают в одну стеклянную емкость, проверяют на чистоту и типичность морфологических признаков(микроскопированием),определяют оптическую концентрацию,разводят,при необходимости, до нужной величины содержания бруцелл в 1,0 см 3. Для повышения концентрации бруцелл в 1 см перед разливом суспензии допускается отсасывание жидкости, и таким путем увеличивают концентрацию микробных клеток. Бактериальную суспензию,слитую с ферментеров, концентрируют (осаждают) путем добавления 2-ного раствора карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) из расчета 0,2 сухого вещества к объему микробной взвеси. После 72 часового осаждения при температуре 2-4 надосадочную часть декантируют, а осадок разбавляют фенолизированным физиологическим раствором до нужной концентрации, разливают во флаконы (ампулы), как указано выше и дополнительно проверяютна чистоту - путем высева на соответствующие питательные средына концентрацию микробных клеток по бруцеллезному стандарту мутности. 4 Изготовление ультразвукового лизата бруцелл Отмыв бакмассу штаммов от примесей питательной среды осуществляют путем фильтрации через трехслойный марлевый фильтр. Далее добавляют 0,05 М триса или 1/15 М двухзамещенного фосфорнокислого натрия. Полученную микробную суспензию подвергают воздействию ультразвуковых волн частотой 22 КГц и мощностью 70-90 вт/см 2, генерируемых аппаратом УЗДН-1 или УЗДН-2. После ультразвукового воздействия полученный дезинтеграт сливают в стерильную емкость, доводятдо 6,5-7,0 автоклавируют при 1,0-1,5 атм в течение 20-30 мин. Выпавший белковый осадок удаляют путем центрифугирования при 5-6 тыс. об/мин в течение 30-40 мин. а надосадочную жидкость сливают, стерилизуют путем прогревания при 80 в течение 60 минут. В полученном полуфабрикате определяют количество общего азота и проверяют на стерильность. До получения результатов контроля полуфабрикат хранят при температуре 2-8 С. Полуфабрикат должен быть стерильным и содержать аминного азота 30-50 мг. 5 Смешивание ультразвуковых лизатов. Ультразвуковые лизаты штаммов 19,82 и- 1 смешивают в стерильной посуде в соотношении 111 при помешивании в течение 10 15 минут при комнатной температуре и приступают к сенсибилизации планшеты. 6 Сенсибилизация планшета антигеном. В лунки планшета вносят 0,1 см 3 раствора штамма бруцелл в ФСБ в концентрации 10 мкг/см 3. Затем планшет накрывают крышкой и оставляют в холодильнике 4 на 18-24 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют, планшет отмывают четырехкратно ФСБ, содержащим 0,05 твина- 20(ФСБ-Т), и в каждую лунку вносят по 0,1 см 3 1 раствора бычьего сывороточного альбумина на ФСБ для блокировки свободных поверхностей твердой фазы. Через 1 час после инкубации при 37 содержимое лунок удаляют, планшет отмывают вышеописанным способом,высушивают,упаковывают в полиэтиленовый пакет и запаивают. 7 Проведение ИФА Комплект перед проведением анализа выдерживают в течение 30 мин при температуре от 20 до 25. Затем планшет промывают один раз ФСБ-Т, при этом в каждую лунку планшета вносят от 200 до 250 мм 3 раствора. По окончании промывки остатки жидкости удаляют активным встряхиванием,постукивая планшетом по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге. Для внесения контрольных сывороток можно использовать любые лунки планшета. Для этого в лунку 1 вносят 100 мм 3 К, в две лунки (2 и 3) - по 100 мм 3 К-, а в еще одну лунку (4) с РБР-С оставляют для контроля конъюгата. Раствор перемешивают пять раз пипетированием. После этого планшет закрывают крышкой или заклеивают клейкой лентой и инкубируют в течение 30 мин при температуре (371). По окончании инкубации планшет промывают ФСБ-Т пять раз, как описано выше. После промывки и удаления влаги в каждую лунку планшета вносят по 100 мм 3 раствора конъюгата. Планшет закрывают крышкой или заклеивают клейкой лентой и инкубируют в течение 30 мин при температуре (371). По окончании инкубации планшет промывают ФСБ-Т пять раз, как описано. В каждую лунку планшета по 100 мм 3 раствора ортофенилендиамин или субстрата тетраметилбензидина. Планшет закрывают крышкой или заклеивают клейкой лентой и помещают на 15 мин в защищенное от света место при температуре(371). Реакцию останавливают внесением в каждую лунку планшета по 50 мм 3 стоп-реагента (0,1 М раствор серной кислоты). 3 8 Учет результатов реакции. Результаты учитываются в течение 3-х ч. после остановки реакции визуально или спектрофотометрически. Результаты ИФА на спектрофотометре. Оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 450 нм. Нулевой уровень (бланк) задают по воздуху. Результаты считаются достоверными только в том случае, если значение ОП в лунке с контролем конъюгата (ОПКг) не превышает 0,15, в лунках с К- среднее значение ОП (ОПК-) не более 0,2, в лунках с К среднее значение ОП (ОПК) не менее 1,0. Визуальный учет для положительной сыворотки антибруцелла КРС при визуальном учете достаточно окрашивание от оранжево-коричневого до коричневого цвета. Пробы с отрицательной сывороткой и конъюгатом не должны изменить окраску или могут иметь слабое пожелтение. Активность препарата проверяли в сравнении с контрольным корпускулярным иммуноферментным диагностикумом. Первоначально было проведено комплексное исследование на бруцеллез в двух неблагополучных по бруцеллезу фермах крупного рогатого скота. Всего проведено комплексное (РСК и ИФА) исследование 237 коров разных возрастов. При серологических исследованиях применялись официально реакция связывания комплемента (РСК), реакция агглютинации (РА) с коммерческими бруцеллезными антигенами и иммуноферментная тест- система, изготовленная по нашей методике (таблица 1). В результате иммуноферментного исследования выявлено наличие бруцеллеза в ИФА у 34 коров комплексным диагностикумом, у 30 коров корпускулярной тест-системой из штамма В.19 что подтверждено в РСК и РА в 21 случае. Далее было проведено комплексное исследование на бруцеллез овец в неблагополучном по указанной болезни хозяйстве. Всего проведено комплексное (РСК, РА и ИФА) исследование 265 овец разных возрастов (таблица 2). В результате комплексного исследования выявлено наличие бруцеллеза овец в ИФА с комплексным антигеном у 28 овец, что подтверждено в РСК и РА в 18 случаях. При этом коммерческим ИФА-диагностикумом результат подтвержден в 25 случаях. Как видно из данных таблицы 2,иммуноферментный диагностикум из смеси ультразвуковых лизатов вакцинных штаммов бруцелл 19,82 и- 1 пригоден для диагностики бруцеллеза разных видов животных. Предлагаемая тест-система из смеси (111) липополисахардных антигенов штаммов 19,82 и- 1 позволяет выявлять бруцеллез разных видов животных, (комплексный антиген способен вступать в реакцию с более высоким количеством детерминантных групп - и - форм бруцелл), и обладает более высокой активностью и специфичностью. Таблица 1 Сравнительная оценка специфичности единой опытной и контрольной иммуноферментных тест-систем при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота Исследовано животных Метод исследования Корпускулярная тест-система В.19 Реагировало положительно абс. Таблица 2 Сравнительная специфичность опытной и контрольной иммуноферментных тест-систем при диагностике бруцеллеза овец Исследовано животных Метод исследования Комплексная ультразвуковая Корпускулярная тест-система тест-система В.- 1 абс. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ изготовления тест-системы для диагностики бруцеллеза животных методом иммуноферментного анализа,включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты антигеном с последующей е инкубацией,4 отличающийся тем,что сенсибилизацию полистироловой планшеты осуществляют антигеном из смеси (111) ультразвуковых лизатов штаммов бруцелл 19,-1,ресуспендированных в забуференном физиологическом растворе с 7,3 (ФСБ) в концентрации 10 мкг/см 3, с последующей инкубацией при 4 в течение 18-24 часа четырехкратным отмыванием забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,05 твина-20 (ФСБ-Т), внесением в каждую лунку по 0,1 см 3 1 раствора бычьего сывороточного альбумина на ФСБ для блокировки свободных поверхностей твердой фазы, а через 1 час после инкубации при 37 удаление содержимого лунок,отмыванием планшета вышеописанным способом,высушиванием, упаковкой в полиэтиленовый пакет и запаиванием.