Способ получения антиидиотипических антител к антигенам вируса бешенства

(51) 61 39/42 (2006.01) 61 39/205 (2006.01) 61 39/395 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИИДИОТИПИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНАМ ВИРУСА БЕШЕНСТВА(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, биотехнологии и иммунологии, а именно,касается способа получения антиидиотипических антител, используемых в качестве одного из препаратов при тестировании сывороток животных на предмет наличия антител против бешенства. Задача разработать способ получения поликлональных антиидиотипических антител пригодных для постановки диагностических реакций по выявлению антирабических антител. Сущность изобретения включает антиидиотипические антитела,имитирующие внутренний образ антигенов вируса бешенства и способные имитировать его в диагностических реакциях, а также способ его получения путем иммунизации животных антирабическими антителами в свою очередь полученных на антигены вируса бешенства с соблюдением на всех этапах принципа видоидентичности животных.(72) Жилин Евгений Сергеевич Кошеметов Жумагали Каукарбаевич Татыбаева Айнура Тлеукановна Матвеева Валентина Михайловна Алиева Алина Бейсеновна Мыктыбаева Гаухар Базарлыевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Акиныпина Т.В., Гринь С.А., Кузнецов Д.П.,Кузнецова СВ., Сазанова Э.Я. Поликлональные антиидиотипические антитела к антигенам культурального вируса бешенства.// Статья в материалах Международной научно-практической конференции Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Щелково, 2005, с.261-266 Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, биотехнологии и иммунологии, а именно, касается способа получения антиидиотипических антител,используемых в качестве одного из препаратов при тестировании сывороток животных на предмет наличия антител против бешенства. Сущность изобретения включает антиидиотипические антитела,имитирующие внутренний образ антигенов вируса бешенства и способные заменять его в диагностических реакциях, а также способ их получения путем иммунизации животных антирабическими антителами в свою очередь полученных на антигены вируса бешенства. Предлагаемое изобретение по сравнению со способами-прототипами характеризуется существенными отличительными признаками,выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования Для получения антиидиотипических антител в предполагаемом изобретении, в отличие от известных способов-прототипов получения антиидиотипических антител описанных в патентах 4731237- и 2205410 Способ получения антиидиотипической сыворотки для диагностики злокачественных опухолей (Пантелеев Дмитрий Юрьевич,Шейн Юрий Германович),не используется гибридомная технология. В отличие от способа-прототипа описанного в работах Акиныниной Т.В., Гринь С.А., Кузнецова Д.П.,Кузнецовой С.В.,Сазановой Э.Я. Поликлональные антиидиотипические антитела к антигенам культурального вируса бешенства // Статья в материалах Международной научнопрактической конференции Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов, - Щелково.-2005.-с.261-266. (аналог изобретения),где используется очищенный вирусный антиген полученный на культурах клеток,в предлагаемом изобретении используется очищенный антиген полученный путем двух интрацеребральных пассажей на животных. Имеется сходство с аналогом изобретения в области метода получения антиидиотипических антител,при котором для получения антиидиотипической сыворотки используются животные, а именно кролики. В отличие от этого способа-прототипа в предлагаемом изобретении для получения антиидиотипической сыворотки, могут быть использованы козы и ослы. Для получения антиидиотипических антител, а именно получение антигенов,получение гипериимунной и антиидиотипической сыворотки в предполагаемом изобретении в отличие аналога изобретения используются только водоидентичные животные, что позволяет избежатьантивидовые реакции при использовании антиидиотипических антител в диагностических тестах. Так при использовании в аналоге изобретения полученный продукт содержал,как антиидиотипические антитела, так и антивидовые антитела. Проведенный заявителем анализ уровня техники,включающий поиск по патентным и научнотехническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемых изобретений, позволил установить,что заявитель не обнаружил источники,характеризующиеся признаками, тождественными(идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого способа, изложенных в независимых пунктах формулы. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности новизна. Задача разработать способ получения поликлональных антиидиотипических антител пригодных для постановки диагностических реакций по выявлению антирабических антител. Решение поставленной задачи достигается следующим образом Антигены вируса бешенства получают путем двух последовательных интрацеребральных пассажей нейропатогенного штамма вируса бешенства на животных молодого возраста (козы - 2-3 мес. возраста, ослы - 2-3 мес. возраста,кролики 5-10 сут. возраста). Вируссодержащий мозг второго пассажного уровня подвергают механической дезинтеграции в растворе фосфатно-солевого буфера 7,4 (гомогенизация 5 тыс. об/мин, 20 мин) и ультрузвуковой дезинтеграции (обработка ультразвуком 22 кГц, 3-х кратно,по 40 сек),с последующим центрифугированием (при 1800, 20 мин). Полученный надосадок концентрируют центрифугированием (при 25000, 90 мин). Осадок ресуспендируют в 1100 первоначального объема растворе фосфатно-солевого буфера 7,4 содержащем 0,05 формалина и инкубируют 12 часов при температуре плюс 4-8. По завершению инкубации препарат вирусного антигена очищают через градиент сахарозы(центрифугирование 15000 , 60 мин). Основная часть вирусного антигена после центрифугирования устанавливается в средней части центрифужной пробирки, после извлечения е подвергают разбавлению в фосфатно-солевом буфере 7,4 и концентрированию центрифугированием(при 25000, 90 мин). Осадок ресуспендируется в 1100 первоначального объема растворе фосфатносолевого буфера 7,4. Антигены полученные, таким образом вводят видоидентичным антигену животным (например,антиген полученный на кроликах вводят кроликам) трех-пятикратно с интервалом 12-14 суток. Для второго введения используют антиген в составе адъюванта. В качестве адъюванта используют минеральное маслои ланолин. После третьего введения отбирают пробы крови, 27436 сыворотки которых исследуют в реакции диффузионной преципитации. При наличии антител в титрах 164 и выше проводят тотальное обескровливание животного. Сыворотку крови подвергают трехступенчатому спиртовому фракционированию, на последней стадии которого получают иммуноглобулиновую фракцию. Полученная таким образом иммуноглобулиновая фракция повергается дополнительной очистке аффинной хроматографией на колонке с агарозой с иммобилизованными, в качестве лиганда,вирусными белками. Конечный продукт антирабических гамма-глобулинов имеет активность в реакции диффузионной преципитации не ниже чем 1128. Полученными антирабическими гаммаглобулинами проводят иммунизацию видоидентичным глобулинам животных (например,глобулин полученный на кроликах вводят кроликам) пяти-десятикратно с интервалом 5-7 суток. Для второго введения используют гаммаглобулины в составе адъюванта. В качестве адъюванта используют масло 71. После пятого и последующих введений отбирают пробы крови, сыворотки которых исследуют в реакции диффузионной преципитации против антирабических гамма-глобулинов. При наличии антиидиотипических антител в титрах 132 и выше проводят тотальное обескровливание животного. Сыворотку крови подвергают трехступенчатому спиртовому фракционированию, на последней стадии которого получают иммуноглобулиновую фракцию, которая является конечным продуктом. Титр антиидиотипических антител в гаммаглобулиновой фракции составляет не менее 132. Полученные антиидиотипические антитела тестируют с видогетерологичными нормальными сыворотками, антирабическими сыворотками от различных видов животных. Являясь имитатором антигена, полученные антиидиотипические антитела положительно реагируют со всеми антирабическими сыворотками, при этом не реагируют с видогетерологичными и видоидентичными нормальными сыворотками. В тоже время антиидиотипические антитела не содержат в себе возбудителей вируса и вирусных антигенов, так как являются сывороточными белками. Таким образом, на основании результатов проведенного исследования можно сделать следующее заключение предлагаемый способ получения поликлональных антиидиотипических антител позволяет получить антиидиотипические антитела, которые имитируют вирусные антигены бешенства, так как положительно реагируют с антирабическими антителами в диагностических реакциях (реакция диффузионной преципитации,иммуноферментный анализ). В тоже время являются специфичными, так как не реагируют с видоидентичными и видогетерологичными нормальными сыворотками и сыворотками полученными на гетерологичные антигены в диагностических реакциях (реакция диффузионной преципитации, иммуноферментный анализ). Данные показатели позволяют рассматривать антиидиотипические антитела в качестве кандидатов в препараты диагностических тестсистем для выявления антирабических антител. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антиидиотипических антител к антигенам вируса бешенства,включающий наработку антигенов путем интрацеребральных пассажей вируса бешенства на молодых животных (козы - 2-3 мес. возраста, ослы 2-3 мес. возраста, кролики - 5-10 сут. возраста),приготовление антирабических сывороток путем введения антигена видоидентичным животным,выделение антирабических антител и получение с их использованием антиидиотипических антител путем проведения иммунизации видоидентичных животных, отличающийся тем, что для получения поликлональных антиидиотипических антител(имитаторов антигена), вместо культурального очищенного антигена, используют очищенный,концентрированный центрифугированием при 1800, 20 мин, дезинтегрированный ультразвуком 22 кГц, 3-х кратно, по 40 сек, инактивированный 0,05 формалином антиген из мозговой ткани,полученную, таким образом, очищенную гаммаглобулиновую фракцию антирабических антител дополнительно к спиртовому фракционированию подвергают аффинной хромотографии, далее при получении непосредственно антиидиотипических антител проводят иммунизацию иммуноглобулиновой фракцией антирабических антител в составе маслянного адъюванта.