Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. – используемый для получения моноклональных антиидиотипических антител к иммуноглобулинам против антигенов бруцелл

(51) 12 5/18 (2009.01) 12 21/08 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ для изучения механизмов регуляции функционирования иммунной системы. Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующего моноклональные антиидиотипические антитела к бруцеллезным антигенам. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей/,иммунизированных моноклональными антителами, направленными к антигенам бруцелл. Полученный штамм обозначают 9, который хранится в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии МОН РК под номером 0216. Секреция МКА на 3-4 день культивирования составляет 25-50 мкг/мл в культуральной среде и 4-8 мг/мл в асцитической жидкости. Моноклональные антиидиотипические антитела относятся классу,подклассу 2,взаимодействуют с бруцеллезными антисыворотками, стимулируют в организме экспериментальных животных выработку антител третьего порядка,положительно взаимодействующих с антигенами бруцелл. Моноклональные антиидиотипические антитела могут быть использованы в разработке диагностических иммуноферментных тест-систем и экспериментальных вакцинных препаратов.(72) Булашев Айтбай Кабыкешович Оспанова Сауле Гельмановна Серикова Шынар Ескендирова Сауле Зиядиновна Шенжанов Канат Толюбаевич Сураншиев Жанболат Амреевич(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ.ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИИДИОТИПИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К ИММУНОГЛОБУЛИНАМ ПРОТИВ АНТИГЕНОВ БРУЦЕЛЛ(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антиидиотипических антител. Продуцируемые гибридным штаммом моноклональные антиидиотипические антитела могут быть использованы для разработки экспериментальных вакцин, безопасных для здоровья исследователей, диагностических тестов для обнаружения бруцеллезных антигенов, а также 24166 Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения антиидиотипических антител к иммуноглобулинам против антигенов бруцелл. Антиидиотипические антитела в настоящее время успешно применяются многими исследователями в качестве суррогата антигена или его отдельных детерминант для индукции против бактериальных ЛПС, токсинов, ряда внутриклеточных паразитов, бактериальных и вирусных инфекций и т.д. Известна технология получения мышиных антиидиотипических антител против иммуноглобулинов кролика, направленных к вирусу герпеса типа 1(ВПГ-1). Полученные антиидиотипические антитела нейтрализовали инфекционную активность вируса (А.А. Кущ, Т.А. Посевая, В.И. Симонов и др. Антиидиотипические антитела к вирусу простого герпеса типа 1 нейтрализуют инфекционную активность вируса.Вопросы вирусологии, 1991,4, с.312-315). С.В. Спицын, Э.И. Дробышевская, О.И. Бархатова и др. изучили возможность получения сингенных антиидиотипических антител к моноклональным антителам противи их использование для стимуляции иммунного ответа к данному микроорганизму. Авторами в сингенной системе получена линия гибридных клеток,синтезирующая моноклональные антиидиотипические антитела к моноклональным антителам против цитолизина. Полученные антиидиотипические антитела стимулировали у мышей линии / выработку антител, часть которых реагировала с исходным антигеном(С.В. Спицын,Э.И. Дробышевская, О.И. Бархатова и д. - Стимуляция иммунного ответа к цитолизину с помощью моноклональных антиидиотипических антител. - Иммунология, 1991, 1, с.26-28). Антиидиотипические антитела были успешно использованы для исследования вируса,идентификации клеточного рецептора реовируса,полиомавируса, вируса кори, цитомегаловируса человека, вируса вирусной диареи быков,риновирусов, вируса клещевого энцефалита (Е.В. Протопопова, А.Д. Хусаинова, С.Н. Коновалова,В.Б. Локтев. - Получение и изучение свойств антиидиотипических антител, несущих на своей поверхности гемагглютинирующие паратопы вируса клещевого энцефалита. Вопросы вирусологии, 1996.2, с.50-53) В литературе также имеются сообщения о получении и перспективах использования антиидиотипических антител к гаптенам. (Мареева Т.Ю./ Автореф. канд диссерт. Антиидиотипические моноклональные антитела к -ацетилглюкозаминил-(1-4) - -ацетилмурамоил-аланилизоглутамину Получение и характеристика, М., 1995, Г.П. Ермаков,С.В. Спицын, В.Г. Нестеренко. Иммуногенность идиотипов моноклональных антидинитрофенильных антител в сингенной системе.Иммунология, 1993,4, с.11-13). 2 Результаты исследований многих авторов свидетельствуют о перспективе использования антиидиотипических антител в качестве диагностических и профилактических препаратов. Так, В.А. Федорова, З.Л. Девдариани получили мышиные антиидиотипические антитела к белкам. , кодируемым плазмидой вирулентности возбудителя чумы, которые обладали свойством защищать от экспериментальной чумы 77-80 мышей (В.А. Федорова, З.Л. Девдариани. Перспективы создания экспериментальных антиидиотипических вакцин против чумы. Иммунология, 2006,3, с.144-148). Б.Б.Гнеденко,С.Г. Морозов, И.Е. Грибова, Т.П. Клюшник и др. использовали 2 фрагменты антиидиотипических антител при разработке модифицированной иммуноферментной тестсистемы для изучения приступообразнопрогредиентной шизофрении (Б.Б. Гнеденко, С.Г. Морозов, И.Е. Грибова, Т.П. Клюшник и др. Иммуноферментный анализ с использованием 2 - фрагментов антиидиотипических антител вместо нативных антигенов.- Иммунология, 2006, 6, с.364-367). В Казахстане были получены поликлональные антиидиотипические антитела, которые были использованы для ранней прижизненной диагностики оводовых болезней лошадей(Ж.У.Еспанов. Применение антиидиотипических антител для ранней прижизненной диагностики оводовых болезней лошадей.- Вестник науки, 1994, 9, с.81-85). Также имеется сообщение об использовании поликлональных антиидиотипических антител при изучении кровепаразитарных болезней животных(Г.С. Шабдарбаева. Иммунобиологические аспекты извлечения антиидиотипических антител в трипананосомозе животных.//Мат. междунар. конференции Современное состояние и перспективы развития производства ветеринарных биопрепаратов., Алматы, 2006). Таким образом,обзор литературы свидетельствует о широком применении антиидиотипических антител в клинических и биологических исследованиях, как в медицине, так и в ветеринарии. Согласно данным обзора литературы,большинство антиидиотипических антител получены к вирусным антигенам. Также следует отметить, что, преимущественно для получения антиидиотипических антител используются моноклональные антитела,специфичные к исходным антигенам. Сообщений о получении антиидиотипических антител против иммуноглобулинов, направленных к антигенам бруцелл, в литературе не обнаружено. Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующих моноклональные антиидиотипические антитела к иммуноглобулинам против антигенов бруцелл. Штамм гибридомы получают следующим образом. 24166 Мышей линии / иммунизируют смесью МКА, направленных против антигенов бруцелл 4-х кратно с 2 х-недельным интервалом, в концентрации 100 мкг на одно животное, соответственно - с полным адъювантом Фрейнда,неполным адъювантом Фрейнда, последующие иммунизации в физиологическом растворе. Через неделю после последней иммунизации вводят бустерную дозу 150 мкг МКА в физиологическом растворе. На седьмой день после последней иммунизации определяют титр антиидиотипических антител в иммунной сыворотке методом иммуноферментного анализа (ИФА) с биотинилированными МКА. Для получения гибридных клеток используют селезенку мышей, в сыворотке которых определен наиболее высокий титр антиидиотипических антител. Гибридизацию проводят по общепринятой методике. В-лимфоциты из соответствующей селезенки подвергают гибридизации с клетками миеломы 63-8-563 в соотношении соответственно 51. Слияние проводят в 1 мл неполной питательной среды-1640,содержащей 45 полиэтиленгликоль с молекулярной массой 4000 и 10 диметилсульфоксид, в течение 1 минуты, при комнатной температуре. Затем добавляют 9 мл теплой неполной среды, выдерживают при температуре 37 С в течение 10 мин. После слияния гибридные клетки отмывают от полиэтиленгликоля и высевают в ячейки 96-луночных планшет на питающий слой перитонеальных макрофагов мыши. На следующий день в эти лунки вносят селективную питательную среду, содержащую гипоксантин-аминоптеринтимидин (ГАТ). Рост гибридных клеток наблюдается на 5-6-й дни после слияния. Гибридомы культивируют в течение 10-21 дней. После 7-10 дней культивирования, гибридные клетки постепенно переводят на среду, содержащую гипоксантин-тимидин (ГТ), затем на полную среду-1640. По мере роста клеток, о чем свидетельствует пожелтение питательной среды,культуральную среду из соответствующих лунок отбирают для определения антиидиотипических антител. Культуральную жидкость тестируют на взаимодействие с биотинилированными моноклональными антителами, использованными для иммунизации мышей в ИФА. По результатам тестирования отбираются гибридные штаммы клеток,активно продуцирующие антиидиотипические антитела. Далее штаммы подвергаются реклонированию, криоконсервации. Для дальнейших исследований отбираются штаммы активно продуцирующие антиидиотипические антитела в течение всех пассажей и сохранившие все свойства после криоконсервации. Штамм гибридных клеток,отвечающий вышеназванным требованиям нами обозначен как 9 депонирован в ДТП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии МОН РК (010000, г. Астана,ул. Ш. Уалиханова, 13/1) под регистрационным номером 0216 и характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные признаки. Гибридные клетки в условияхадаптированы к росту в среде-1640,содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-15) 20 мл/л 200 мМ -глютамина- 3,375 г/л 2 меркаптоэтанола - 0,003 мл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия - 3,7 г/л. Клетки культивируют в пластиковых матрацах при 37 С в атмосфере 5 2. Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация 1106 клеток в 1 мл. Рост клеток ведут до достижения плотности монослоя в пределах 75-80 или концентрации клеток не выше 0,5106 в 1 мл. Частота пассирования 3-4 суток. В условияхасцитическая жидкость накапливается в течение 1014 дней после введения клеток в организм мышей линии /. Продуктивность штамма. На 3-4-й день культивирования гибридомы концентрация МКА составляет 25-50 мкг/мл в культуральной среде и 4-8 мг/мл в очищенной асцитной жидкости. Титры иммуноглобулинов в иммуноферментной реакции с биотинилированными моноклональными антителами, использованными для иммунизации,составляют в культуральной жидкости 18, в асцитической жидкости 13200. Характеристика полезного продукта. МКА относятся к иммуноглобулинам класса , подкласса 2. Константа связывания 110-7 М. Методы оценки специфичности МКА ИФА. Контаминация. Контаминация бактериями,грибами и микоплазмами не обнаружена. Криоконсервирование. Гибридные клетки снимают с матраца мягким пипетированием и переносят в отдельные центрифужные пробирки. Осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. К осадку гибридных клеток добавляют сыворотку плода коровы (0,9 мл), затем диметилсульфоксид 0,1 мл. Суспензию гибридных клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающими крышками по 1 мл (1 х 106 кл.),помещают в коробку из пенопласта и переносят в низкотемпературный холодильник при -70 С на 16-18 часов. Затем ампулы с гибридными клетками переносят в контейнеры с жидким азотом (-196 С). Условия размораживания. Ампулу с гибридными клетками вынимают из сосуда с жидким азотом и помещают в водяную баню, нагретую до 37 С. Как только растают кусочки льда, суспензию гибридных клеток переносят в отдельную стерильную центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной неполной ростовой среды, отмывают один раз путем центрифугирования в течение 10 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют,осадок клеток ресуспендируют в полной ростовой среде, нагретой до комнатной температуры, и высевают в ячейки 24-луночного планшета с питающим слоем перитонеальных макрофагов. 3 24166 Штамм гибридомы 9 используют как продуцент моноклональных антиидиотипических антител следующим образом. Гибридные клетки высевают в пластиковые матрацы площадью 25 см 3 по 5 х 105 клеток в 5 мл ростовой среды и инкубируют 3-4 дня при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Культуральную среду собирают и центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин с целью отделения клеток от надосадочной жидкости,содержащей антитела. Для наработки препаративного количества МКА осадок гибридных клеток разводят неполной ростовой средой в объеме 0,5 мл и вводят внутрибрюшинно (в концентрации 1-2 млн. клеток) мышам линии(2,6,10,14-тетраметилпентадексан). Через 10-14 дней после прививки гибридных клеток мышей забивают путем цервикальной дислокации, стерильным шприцом отсасывают асцитную жидкость, вводя иглу в брюшную полость. Асцитную жидкость собирают в центрифужные пробирки и очищают от гибридных клеток центрифугированием в течение 6-8 мин при 1000 об/мин. Очистку МКА осуществляют методом высаливания насыщенным раствором сульфата аммония. Антиидиотипические антитела вида Ат 2,являющиеся внутренним образом бруцеллезного антигена определяют следующими способами. Пример 1. Определение способности антиидиотипических антител взаимодействовать с ксеногенными сыворотками, положительными по бруцеллезу. Полистироловые планшеты сенсибилизируют ксеногенными моноспецифическими сыворотками,положительными по бруцеллезу в концентрации 5 мкг/мл в бикарбонатном буфере рН 9,5. Затем блокируют 1 раствором БСА в течение 1 часа. После отмывки, наносят серийные разведения антиидиотипических антител в фосфатно-солевом буфере с добавлением 0,05 раствора твина, далее обрабатывают конъюгатом кроличьих антител против иммуноглобулинов мышей. Реакцию проявляют ортофенилендиамином. В качестве отрицательного контроля используют нормальную сыворотку животных. Титр антиидиотипических антител продуцируемых штаммом 9 по результатам реакции составляет 11600-13200, что свидетельствует о присутствии антиидиотипических антител вида АТ 2 являющихся внутренним образом антигенов бруцелл. Пример 2. Определение способности антиидиотипических антител индуцировать в организме животных иммунный ответ к исходному антигену - антигену бруцелл. Для этой цели мышей линии / иммунизируют антиидиотипическими антителами в количестве 100 мкг на одно животное, 4-х кратно, с двухнедельным интервалом. На 4-й день после последней инъекции иммунную сыворотку тестируют в ИФА на взаимодействие с бруцеллезным антигеном. В качестве положительного контроля используют сыворотку,полученную при иммунизации поли-В антигеном. В качестве отрицательного контроля - сыворотку неиммунизированной мыши. По результатам иммуноферментного анализа антиидиотипические антитела стимулировали синтез противобруцеллезных антител в титрах 1160013200. Титр положительного контроля составил 16400-112800. В случае отрицательного контроля реакция отсутствовала. Результаты исследований свидетельствуют о том, что штамм гибридомы 9 продуцирует антиидиотипические антитела, в составе которых присутствуют антиидиотипические антитела вида Ат 2,являющиеся внутренним образом бруцеллезного антигена, которые могут быть использованы для разработки биологически безопасных диагностических и профилактических средств. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гибридных культивируемых клеток животных. 9, депонированный в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии МОН РК, под номером 0216, используемый для получения моноклональных антиидиотипических антител к иммуноглобулинам против антигенов бруцелл.