Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. – используемый для получения моноклональных антител к вирусу Y картофеля

(51) 12 5/12 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ. - ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ВИРУСУКАРТОФЕЛЯ(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в разработке диагностических тестов для обнаружения вирусакартофеля, а также для дифференциации вирусакартофеля от других видов вирусов растений. Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующего МКА к антигену вирусакартофеля.(72) Боровиков Сергей Николаевич Куйбагаров Марат Амангельдыевич Дюсенова Гульшат Талаповна Манадилова Алия Молдахановна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ 24165 Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в разработке диагностических тестов для обнаружения вирусакартофеля, а также для дифференциации вирусакартофеля от других видов вирусов. В настоящее время для диагностики вирусов картофеля используются серологические реакции,такие как капельная преципитация, радиальная иммунодиффузия в агаре (РИДА), двойная иммунодиффузия в агаре (ДИДА), латексагглютинация (ЛА), которые даже при их комплексном применении не позволяют выявить все зараженные растения (Швидченко В.К., Созинова Л.Ф. Оздоровление, размножение и диагностика в картофелеводстве. - Астана.-2000. - с.161). Способы диагностики вирусных болезней картофеля основанные на ИФА, имеют большую перспективу в части внедрения в практику. Однако,недостатком иммуноферментных способов диагностики является использование в них поликлональных антител, что снижает их специфичность, чувствительность и является главным препятствием при внедрении в диагностическую практику. Поэтому ИФА как диагностический тест будет иметь ценность лишь в том случае, когда в нем будут использованы в качестве основного реагента способа моноклональные антитела (МКА), позволяющие качественно повысить специфичность анализа,характеризующиеся постоянными свойствами, т.е. имеющие моноклональное происхождение и доступные в неограниченном количестве. Имеются данные об успешном применении в диагностике вирусных болезней картофеля поликлональных антител к рекомбинантному белку вируса( ,,... 200246(3) 147-51.). Известны штаммы гибридных культивируемых клеток, синтезирующие МКА к антигенам вирусакартофеля ( ,,.().. 1996 4023-6). Описанные выше моно - и поликлональные антитела используются при детекции вирусов картофеляи А. Наиболее близкими к предлагаемому изобретению прототипом является штамм гибридных культивируемых клеток (см. С.М. Амбросова, Ю.С. Малафеева, Ю.А. Варицев. Моноклональные антитела к и их иммунохимическая характеристика/Биоорганическая химия, 1996,1,том 22, с.24-28). МКА которого реагировали с 5 изолятами вируса скручивания листьев картофеля. Предлагаемый штамм гибридных культивируемых клеток отличается от аналога тем, что получен в результате гибридизации иммунных спеленоцитов линейной мыши с клетками миеломы 63-8-563(1106) в с помощью 45 полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000, тогда как при создании аналога использовалась миеломная линияи полиэтиленгликоль 1500. Кроме того,2 синтезируюсинтезируемые штаммом моноклональные антитела не реагируют с другими видами фитовирусов, тогда как МКА аналога вступали в перекрестную реакцию с гетерологичным лютеовирусом. Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующих моноклональные антитела к вирусукартофеля. Штамм получают следующим образом. Мышам линии / в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг очищенного антигена из вирусакартофеля в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда. На 7, 11, 12, 13-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг этого же антигена в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), рН 7,2-7,4. Спустя 4 дня после последней иммунизации извлекают селезенку мышей, которые имеют высокие титры антител в сыворотке крови по результатам твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА). Клетки селезенки (В-лимфоциты) иммунных мышей в количестве 1 х 107 гибридизируют с клетками миеломы 63-8-563 (1106) в 1 мл неполной питательной среды,содержащей 45 полиэтиленгликоль с молекулярной массой 4000 и 10 диметилсульфоксид. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля их высевают в ячейки 96-луночной панели на слой перитонеальных макрофагов мыши. На следующий день в эти лунки вносят селективную питательную среду, содержащую гипоксантин-аминоптерин-тимидин (ГАТ). Через 1014 дней после слияния из лунок, имеющих колонии клеток размером 2-3 мм, отбирают культуральную среду, содержащую антитела для определения продуктивности гибридных клеток. Тестирование проводят методом ТИФА с использованием антигена очищенного антигена вирусакартофеля и кроличьих иммуноглобулинов к антителам мыши,меченых пероксидазой хрена. В течение 21 дня после слияния, гибридные клетки культивируют на среде с ГАТ и затем постепенно переводят на среду,содержащую гипоксантин-тимидин (ГТ) и полную среду -1640. Клоны гибридных клеток,продуцирующих МКА к антигенам вирусакартофеля,дважды клонируют методом лимитирующих разведений. После второго клонирования 95 субклонов должны продуцировать антитела к тестируемому антигену. Продуктивный клон гибридомы, обозначенный как/48 депонирован в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии МОН РК (010000, г. Астана, ул. Ш. Уалиханова, 13/1) под регистрационным номером - 0217 и характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные признаки. Гибридные клетки адаптированы к росту в среде -1640, 24165 содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-20) 20 мл/л 200 мМ-глютамина- 3,375 г/л 2-меркаптоэтанола 0,003 мл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия - 3,7 г/л. Клетки культивируют в пластиковых матрацах при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация 2106 клеток в 1 мл. Рост клеток ведут до достижения плотности монослоя в пределах 75-80 или концентрации клеток не выше 0,5106 в 1 мл. Частота пассирования 3-4 суток. Продуктивность штамма. На 3-4-й день культивирования гибридомы концентрация МКА составляет 0,035-0,040 мг/мл в культуральной среде и 4-8 мг/мл в очищенной асцитной жидкости. Титры иммуноглобулинов культуральной среды по отношению к исходному антигену составляют в ТИФА-132, в асцитной жидкости 112800. Характеристика полезного продукта. МКА относятся к иммуноглобулинам класса , подкласса 3. Константа связывания 1 х 10-9 М. Способы оценки специфичности МКА ТИФА. Контаминация. Контаминация бактериями,грибами и микоплазмами не обнаружена. Криоконсервирование. Гибридные клетки снимают с матраца мягким пипетированием и переносят в отдельные центрифужные пробирки. Осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 6-8 мин. К осадку гибридных клеток добавляют сыворотку плода коровы (0,9 мл), а затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10. Суспензию гибридных клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающими крышками по 1 мл (1-5106 кл.),помещают в коробку из пенопласта и переносят в низкотемпературный холодильник при -70 С на 1618 часов. Затем ампулы с гибридными клетками переносят в контейнеры с жидким азотом (-196 С). Условия размораживания. Ампулу с гибридными клетками вынимают из сосуда с жидким азотом и помещают в водяную баню, нагретую до 37 С. Как только растают кусочки льда, суспензию гибридных клеток переносят в отдельную стерильную центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной неполной ростовой среды, отмывают один раз путем центрифугирования в течение 6-8 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют,осадок клеток ресуспендируют в полной ростовой среде, нагретой до комнатной температуры, и высевают в ячейки 24-луночного планшета с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Штамм гибридомы /48- используют следующим образом. Пример 1. Гибридные клетки высевают в пластиковые матрацы площадью 25 см по 5105 клеток в 5 мл ростовой среды и инкубируют 3-4 дня при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Культуральную среду собирают и центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин с целью отделения клеток от надосадочной жидкости, содержащей антитела. Для наработки препаративного количества МКА осадок гибридных клеток разводят неполной ростовой средой в объеме 0,5 мл и вводят внутрибрюшинно (в концентрации 1-2 млн. клеток) мышам линии /, которым предварительно инъецировали пристан(2,6,10,14-тетраметилпентадексан). Через 10-14 дней после прививки гибридных клеток мышей забивают путем цервикальной дислокации, стерильным шприцом отсасывают асцитную жидкость, вводя иглу в брюшную полость. Асцитную жидкость собирают в центрифужные пробирки и очищают от гибридных клеток центрифугированием в течение 6-8 мин при 1000 об/мин. Очистку МКА осуществляют методом высаливания насыщенным раствором сульфата аммония. Специфичность определяют в ТИФА с использованием антигенов различных видов вирусов растений. Для проведения ТИФА на 96-луночный полистироловый планшет сорбируют очищенные антигены в концентрации 10 мкг/мл в 100 мкл ЗФР,рН 7,2-7,4. Инкубируют при 4 С в течение ночи или 2 часа при 37 С. Затем планшет отмывают 3 раза ЗФР с 0,05-ным твином-20 (ЗФР-Тв) и 3 раза ЗФР. В лунках вертикальных рядов планшета готовят двукратные разведения исследуемой культуральной жидкости (КЖ) или асцитной жидкости (АЖ) начиная с разведения 1100 и выше в 0,1 мл ЗФР-Тв. Одновременно ставят контроли с культуральной жидкостью миеломных клеток в тех же разведениях и с ЗФР-Тв. Затем планшет накрывают крышкой и инкубируют в термостате при 37 С в течении 1 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют,повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл рабочего разведения конъюгата(антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой) в ЗФР-Тв. Через 1 час после инкубации при 37 С повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл свежеприготовленной субстратной смеси (5 мг ортофенилендиамина растворяют в 10 мл 0,05 М цитратно-фосфатного буфера, рН 4,5 и добавляют 0,025 мл 3-ного перекиси водорода). Затем планшет накрывают крышкой и оставляют в темном месте при комнатной температуре. Через 10-15 мин экспозиции реакцию останавливают путем внесения в каждую лунку по 0,1 мл 2 М раствора 204. Результаты реакции учитывают на спектрофотометре путем измерения оптической плотности жидкости в каждой лунке при длине волны 492 нм. Положительная реакция характеризуется появлением в лунках темнокоричневого окрашивания, при отрицательной содержимое лунок остается бесцветным или имеет светло-желтое окрашивание. Титром моноклональных антител считают их максимальное разведение, величина оптической плотности в котором в 2 и более раза превосходит оптическую плотность в лунках с отрицательным контролем. Результаты опыта по определению специфичности МКА в ТИФА представлены в таблице. 24165 Таблица Титры МКА Культуральная Асцитная жидкость жидкость Растворимые антигены фитовирусов 1(очищенный препарат вируса) 132 112800,116 16400 2,12 1100 3,12 1200 4,12 1100 Примечание - РО - реакция отрицательная. Как видно из приведенных в таблице 1 использованием путем растворения 0,01 г результатов, полученные моноклональные антитела ортофенилендиамина (ОФД) (, США) в 10 мл проявляют высокую активность к контрольным 1 раствора лимонной кислоты с рН 4,5 и референс-антигенами слабо реагируют с добавлением 0,005 мл 30 перекиси водорода. антигенами других видов вирусов картофеля. Планшет инкубируют 10-15 минут при комнатной Таким образом,результаты опыта температуре. Положительная реакция свидетельствуют о специфичности МКА гибридомы характеризуется окрашиванием раствора субстрата в/48- к антигенам , что позволяет желто-коричневый цвет. Реакцию останавливают получать на их основе эффективные добавлением в лунки планшет раствора 2 М серной диагностические препараты для индикации и кислоты. Результаты ИФА учитывают с помощью дифференциации вирусакартофеля. спектрофотометра с вертикальным потоком света при Пример 2. На 96-луночный планшет для длине волны 492 нм. иммунологических реакций (, Дания) сорбируют Исследование проб растительного материала с гипериммунную сыворотку в 100 мкл помощью сэндвич варианта ИФА, показало бикарбонатного буфера (рН 9,6) при 4 С в течение специфичность моноклональных антител к ночи. Затем панель отмывают по три раза ЗФР-Тв и эпитопам антигена вирусакартофеля. ЗФР и вносят в ячейки, предварительно подготовленный растительный материал и контроли. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ После инкубации при 37 С в течение 1 часа, панель отмывают описанным способом, готовят в ячейках Штамм гибридных культивируемых клеток разведения МКА в виде культуральной и асцитной животных. /48-,жидкости. После выдерживания панели при 37 С в депонированный в ДГП Республиканская течение 1,5 ч повторяют процедуру отмывки и в коллекция микроорганизмов РГП Национальный ячейки вносят кроличьи антитела противмыши центр биотехнологии МОН РК, продуцирующий(антивидовой коньюгат), меченные пероксидазой моноклональные антитела к вирусукартофеля. хрена. Субстрат готовят непосредственно перед