Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. – используемый для получения моноклональных антител к Mucobacterium bovis

(51) 12 5/12 (2006.01) 61 39/40 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ.-ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в разработке диагностического теста для обнаружения антигенов возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота, а также для дифференциацииот других видов микобактерий. Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующего МКА к белковому антигенуштамм 8 с молекулярной массой 35 кД.(72) Сураншиев Жанболат Амреевич Акибеков Оркен Султанхамитович Булашев Айтбай Кабыкешович Боровиков Сергей Николаевич Шенжанов Канат Толюбаевич Куйбагаров Марат Амангельдыевич(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина 24164 Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в разработке диагностических тестов для обнаружения антигенов возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота, а также для дифференциацииот других видов микобактерий. Основным способом прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота является аллергический (Жумаш А.С., Тургенбаев К.А. Пути оздоровления хозяйств от туберкулеза крупного рогатого скота. - Алматы, 2005. - с.68-70). Для этой цели используется сухой, очищенный ППДтуберкулин для млекопитающих, эффективность которого не отвечает современным требованиям,т.к. в некоторых случаях особенно в благополучных хозяйствах у животных на ППД-туберкулин отмечаются парааллергические реакции. Развитие перекрестных реакций у здоровых животных на инъекцию туберкулина связано с сенсибилизацией организма атипичными микобактериями,имеющими много общих антигенных эпитопов с патогенными видами микобактерий. Частота ложноположительных реакций,по данным литературы, колеблется от 1 до 3 и выше, что затрудняет определение истинной эпизоотической ситуации по туберкулезу и приводит к неоправданной выбраковке здоровых животных. Для решения указанных проблем в последние годы успешно используются моноклональные антитела(МКА). МКА находят широкое применение в ветеринарии и медицине как иммунодиагностические реагенты для обнаружения возбудителей инфекционных болезней и специфических к ним антител, для типирования клеток крови, идентификации микроорганизмов и онкогенов. Иммуноферментные диагностикумы на основе МКА характеризуются специфичностью,простотой постановки, имея при этом высокую чувствительность и производительность. С этой точки зрения создание диагностикумов, основанных на использовании МКА в иммуноферментном анализе (ИФА), является актуальной задачей ветеринарной медицины. Известны штаммы гибридных культивируемых клеток, синтезирующие МКА к белку возбудителя туберкулеза человеческого вида -(Л.Н. Черноусова, Н.В. Куликовская, Разумовская. Получение и характеристика моноклональных антител,реагирующих свида .-Журнал Проблемы туберкулеза, 1990,2. с.49-51). МКА данных гибридом не вступали в перекрестную реакцию с другими видами микобактерий. Получены два штамма гибридом,вырабатывающие МКА, специфичные к атипичным микобактериям (Н.В. Куликовская, М.А. Капина,О.А. Калинина, Л.Н. Черноусова. Получение и характеристика моноклональных антител к микобактериями .-Журнал Проблемы туберкулеза, 1996,2. с.43-46). МКА гибридом описанных выше не могут быть использованы в разработке способов индикации возбудителя туберкулеза животных, так как первые 2 имеют родство к возбудителю туберкулеза человеческого вида, а вторые к атипичным микобактериям. В литературе описан штамм гибридомы МВ-8,синтезирующий МКА к ППД-туберкулину для млекопитающих(Штамм гибридных культивируемых клеток животных. продуцент моноклональных антител к ППДтуберкулину. А.К. Булашев, К.Т. Шенжанов, С.З. Ескендирова, Г.А. Бакирова. Предварительный патент 11411, Бюл.4 от 15.04.2002). По данным авторов МКА штамма гибридомы МВ-8 взаимодействовали с ППД антигеном, а также с туберкулезным фильтратомштамма 8 и очень слабо реагировали с безальбумозным туберкулином и цельными клетками. Исходя из вышеизложенного МКА гибридомы МВ-8 имеют ограниченное применение в связи с тем, что очень слабо реагируют с цельными клетками. Это обстоятельство не позволит использовать данный тип МКА для диагностики туберкулеза животных. Наиболее близкими к предлагаемому изобретению являются три штамма гибридных культивируемых клеток синтезирующих МКА,полученные сотрудниками Российского НИИ туберкулеза и пульмонологии (М.В. Андросова,М.А. Владимирский, О.В. Василенкова, Л.М. Ходун. Иммуноферментный анализ для идентификации микобактерий туберкулеза бычьего вида с помощью моноклональных антител.Журнал проблемы туберкулеза, 1996,2, с.40-43). МКА этих штаммов реагировали с поверхностным антигеном микобактерий бычьего вида, в том числе си клиническими штаммами, выделенными от больных туберкулезом людей и животных. По данным иммуноблотинга МКА данной гибридомы связывались с эпитопами белка Микобактерий с молекулярной около 31 кД. Предлагаемый штамм гибридных культивируемых клеток отличаются от аналогов тем, что продуцируемые штаммом моноклональные антитела получены к белковому антигенуштамм 8 с молекулярной массой 35 кДа. Кроме того, синтезируемые штаммом / 8 моноклональные антитела строго специфичны кштамм 8 и не реагируют с другими видами как патогенных,так и атипичных Микобактерий. Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующих моноклональные антитела к белковому антигенуштамма 8 с молекулярной массой 35 кД. Штамм получают следующим образом. Мышам линии / в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг белкового антигена изштамма 8 с молекулярной массой 35 кД в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда. На 7, 11, 12, 13-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг 24164 этого же антигена в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), рН 7,2-7,4. Спустя 4 дня после последней иммунизации извлекают селезенку мышей, которые имеют высокие титры антител в сыворотке крови по результатам твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА). Клетки селезенки (В-лимфоциты) иммунных мышей в количестве 1 х 107 гибридизируют с клетками миеломы 63-8-563 (1106) в 1 мл неполной питательной среды,содержащей 45 полиэтиленгликоль с молекулярной массой 4000 и 10 диметилсульфоксид. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля их высевают в ячейки 96-луночной панели на слой перитонеальных макрофагов мыши. На следующий день в эти лунки вносят селективную питательную среду, содержащую гипоксантин-аминоптеринтимидин (ГАТ). Через 10-14 дней после слияния из лунок, имеющих колонии клеток размером 2-3 мм,отбирают культуральную среду, содержащую антитела для определения продуктивности гибридных клеток. Тестирование проводят методом ТИФА с использованием антигенаштамм 8 и кроличьих иммуноглобулинов к антителам мыши, меченных пероксидазой хрена. В течение 21 дня после слияния, гибридные клетки культивируют на среде с ГАТ и затем постепенно переводят на среду, содержащую гипоксантинтимидин (ГТ) и полную среду -1640. Клоны гибридных клеток, продуцирующих МКА к антигенамштамм 8, дважды клонируют методом лимитирующих разведений. После второго клонирования 95 субклонов должны продуцировать антитела к тестируемому антигену. Продуктивный клон гибридомы, обозначенный как/ 8 депонирован в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии МОН РК (010000, г. Астана, ул. Ш. Уалиханова, 13/1) под регистрационным номером - 0214 и характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные признаки. Гибридные клетки адаптированы к росту в среде -1640,содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-20) 20 мл/л 200 мМ-глютамина- 3,375 г/л 2-меркаптоэтанола 0,003 мл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия - 3,7 г/л. Клетки культивируют в пластиковых матрацах при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация 2106 клеток в 1 мл. Рост клеток ведут до достижения плотности монослоя в пределах 75-80 или концентрации клеток не выше 0,5 х 106 в 1 мл. Частота пассирования 3-4 суток. Продуктивность штамма. На 3-4-й день культивирования гибридомы концентрация МКА составляет 0,035-0,040 мг/мл в культуральной среде и 4-8 мг/мл в очищенной асцитной жидкости. Титры иммуноглобулинов культуральной среды по отношению к исходному антигену составляют в ТИФА-164, в асцитной жидкости 125600. Характеристика полезного продукта. МКА относятся к иммуноглобулинам класса , подкласса 3. Константа связывания 1 х 10-9 М. Способы оценки специфичности МКА ТИФА и иммуноблотинг. Контаминация. Контаминация бактериями,грибами и микоплазмами не обнаружена. Криоконсервирование. Гибридные клетки снимают с матраца мягким пипетированием и переносят в отдельные центрифужные пробирки. Осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 6-8 мин. К осадку гибридных клеток добавляют сыворотку плода коровы (0,9 мл), а затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10. Суспензию гибридных клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающими крышками по 1 мл (1-5 х 106 кл.),помещают в коробку из пенопласта и переносят в низкотемпературный холодильник при -70 С на 1618 часов. Затем ампулы с гибридными клетками переносят в контейнеры с жидким азотом (-196 С). Условия размораживания. Ампулу с гибридными клетками вынимают из сосуда с жидким азотом и помещают в водяную баню, нагретую до 37 С. Как только растают кусочки льда, суспензию гибридных клеток переносят в отдельную стерильную центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной неполной ростовой среды, отмывают один раз путем центрифугирования в течение 6-8 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют,осадок клеток ресуспендируют в полной ростовой среде, нагретой до комнатной температуры, и высевают в ячейки 24-луночного планшета с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Штамм гибридомы / 8 используют следующим образом. Пример 1. Гибридные клетки высевают в пластиковые матрацы площадью 25 см 3 по 5 х 105 клеток в 5 мл ростовой среды и инкубируют 3-4 дня при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Культуральную среду собирают и центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин с целью отделения клеток от надосадочной жидкости, содержащей антитела. Для наработки препаративного количества МКА осадок гибридных клеток разводят неполной ростовой средой в объеме 0,5 мл и вводят внутрибрюшинно (в концентрации 1-2 млн. клеток) мышам линии /, которым предварительно инъецировали пристан(2,6,10,14-тетраметилпентадексан). Через 10-14 дней после прививки гибридных клеток мышей забивают путем цервикальной дислокации, стерильным шприцом отсасывают асцитную жидкость, вводя иглу в брюшную полость. Асцитную жидкость собирают в центрифужные пробирки и очищают от гибридных клеток центрифугированием в течение 6-8 мин при 1000 об/мин. Очистку МКА осуществляют методом высаливания насыщенным раствором сульфата аммония. 3 24164 Специфичность определяют в ТИФА с использованием антигенов различных видов микобактерий. Для проведения ТИФА на 96-луночный полистироловый планшет сорбируют корпускулярные и растворимые антигены микобактерий в концентрации 10 мкг/мл в 100 мкл ЗФР, рН 7,2-7,4. Инкубируют при 4 С в течение ночи или 2 часа при 37 С. Затем планшет отмывают 3 раза ЗФР с 0,05-ным твином-20 (ЗФР-Тв) и 3 раза ЗФР. В лунках вертикальных рядов планшета готовят двукратные разведения исследуемой культуральной жидкости (КЖ) или асцитной жидкости (АЖ) начиная с разведения 1100 и выше в 0,1 мл ЗФР-Тв. Одновременно ставят контроли с культуральной жидкостью миеломных клеток в тех же разведениях и с ЗФР-Тв. Затем планшет накрывают крышкой и инкубируют в термостате при 37 С в течении 1 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют, повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл рабочего разведения конъюгата (антитела кролика против иммуноглобулинов мыши,меченные пероксидазой) в ЗФР-Тв. Через 1 час после инкубации при 37 С повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл свежеприготовленной субстратной смеси (5 мг ортофенилендиамина растворяют в 10 мл 0,05 М цитратно-фосфатного буфера, рН 4,5 и добавляют 0,025 мл 3-ного перекиси водорода). Затем планшет накрывают крышкой и оставляют в темном месте при комнатной температуре. Через 10-15 мин экспозиции реакцию останавливают путем внесения в каждую лунку по 0,1 мл 2 М раствора 24. Результаты реакции учитывают на спектрофотометре путем измерения оптической плотности жидкости в каждой лунке при длине волны 492 нм. Положительная реакция характеризуется появлением в лунках темнокоричневого окрашивания, при отрицательной содержимое лунок остается бесцветным или имеет светло-желтое окрашивание. Титром моноклональных антител считают их максимальное разведение, величина оптической плотности в котором в 2 и более раза превосходит оптическую плотность в лунках с отрицательным контролем. Результаты опыта по определению специфичности МКА в ТИФА представлены в таблице 1. Таблица 1 Титры МКА Культуральная Асцитная жидкость жидкость Растворимые антигенышт. 8 1 Белковый антиген 164 125600 2 Культуральный фильтрат 14 11600 3 ППД-туберкулин для млекопитающих 14 1800 Цельные клетки 4 шт. 8 14 16400 537 РО РО 6 РО РО 7 РО РО 8 РО РО 9 РО РО 10 РО РО Примечание - РО - реакция отрицательная. Как видно из приведенных в таблице 1 результатов, полученные моноклональные антитела проявляют высокую активность к растворимым антигенам и цельным клеткамшт.8 и не реагируют с другими видами микобактерий. Таким образом, результаты опыта свидетельствуют о специфичности МКА гибридомы/ 8 к, что позволяет получать на их основе эффективные диагностические препараты для индикации и дифференциации возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота. Пример 2. Образцы белкового антигенаштамм 8 в количестве 10 мкг подвергают электрофорезу в 7-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Электрофореграмму переносят на нитроцеллюлозную мембрану в 4 течение 2 часов при силе тока 60 В и 250 мА. Свободные участки носителя блокируют 1-ным бычьим сывороточным альбумином в ЗФР, рН 7,27,4 (18 ч при 4 С или 2 ч при 37 С), затем отмывают по 3 раза ЗФР и инкубируют 1,5 ч при 37 С с МКА из очищенной асцитной жидкости, разведенной 1100 ЗФР-Тв. После этого носитель отмывают 3 раза ЗФР-Тв и ЗФР, затем его выдерживают в рабочем разведении антимышиных антител,меченных пероксидазой (1 ч при 37 С). Повторяют процедуру отмывки и проявляют реакцию с помощью 4-хлор-1-нафтола. Иммунохимическое проявление фракций белков в иммуноблотинге с применением моноклональных антител и антимышиных антител, меченных пероксидазой хрена, показало специфичность моноклональных антител к эпитопам белка,молекулярная масса которого соответствовала 35 кД. 24164 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гибридных культивируемых клеток животных коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии МОН РК, продуцирующий моноклональные антитела к белковому антигену