Биологический чистый бактериальный штамм для биоочистки от углеводородов нефти, способ биоочистки с устранением нефтяных загрязнителей из почвы с его помощью и способ обработки почвы (варианты)

(51) 12 1/26 (2009.01) 09 1/10 (2009.01) 12 1/05 (2009.01) 12 1/00 (2009.01) 12 1/40 (2009.01) 12 1/38 (2009.01) 12 1/44 (2009.01) 12 1/425 (2009.01) 12 1/41 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ БИООЧИСТКИ ОТ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ,СПОСОБ БИООЧИСТКИ С УСТРАНЕНИЕМ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ ИЗ ПОЧВЫ С ЕГО ПОМОЩЬЮ И СПОСОБ ОБРАБОТКИ ПОЧВЫ (ВАРИАНТЫ)(57) Были идентифицированы новые штаммы изолированных и очищенных бактерий, которые обладают способностью деградировать углеводороды нефти,включая различные полиароматические углеводороды. Несколько изолятов демонстрируют также способность производить биосурфактант. Сочетание способности производить биосурфактант со способностью деградировать полиароматические углеводороды усиливает эффективность, с которой могут подвергаться деградации полиароматические углеводороды. Дополнительно биосурфактант обеспечивает также дополнительную способность связывать ионы тяжелых металлов для удаления их из почвы или водной среды.(73) САВАННА РИВЕР НЬЮКЛИА СОЛЮШНЗ,ЛЛК(74) Шабалина Галина Ивановна Шабалин Владимир Иванович Кучаева Ирина Гафиятовна(54) БИОЛОГИЧЕСКИЙ ЧИСТЫЙ БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ШТАММ ДЛЯ 24163 Заявка на права по изобретениям сделана в рамках федеральной программы исследований и развития Это изобретение сделано на основе государственной поддержки по контракту 09-9618500, присужденной Департаментом Энергии Соединенных Штатов Америки. Государство имеет определенные права на изобретение. Область техники, к которой относится изобретение Это изобретение направлено на штаммы бактерий, полезных для биоочистки окружающей среды, и способы применения этих бактериальных штаммов. В частности, оно относится к уникальным изолятам бактерий, которые могут обеспечивать деградацию полиароматических углеводородов(ПАУ), и к способам применения этих новых штаммов бактерий для биоочистки. Для одного из штаммов была продемонстрирована также возможность биоочистки свинца за счет уменьшения его биоаккумуляции, что свидетельствует о возможности двойного применения бактериальных изолятов для устранения как органических, так и неорганических соединений. Уровень техники При описании изобретения рассмотрены различные научные статьи и патенты. Эти публикации включены сюда путем ссылки для описания состояния в той области, к которой относится это изобретение, и для обеспечения детального знания стандартных методик и аппаратуры, которые могут быть полезными в практике различных воплощений настоящего изобретения. ПАУ являются достаточно широко распространенными соединениями, являющимися общеизвестными загрязнителями, которые, в частности, обнаруживаются в ассоциации с продуктами перегонки нефти, определенными очищенными нефтепродуктами, местами хранения и местах разлива нефти. Высокие концентрации ПАУ обладают мутагенным и канцерогенным действием на людей и представляют высокий риск для миграции и загрязнения почвы и источников грунтовых вод. Вследствие этого существует значительный интерес к технике и способам, которые будут обеспечивать деградацию ПАУ и родственных нефтяных продуктов для улучшения состояния окружающей среды. Применение биологических агентов для обработки ПАУ хорошо известно специалистам. Патент 6503746 описывает штаммы бактерий семейства Васасеае, которые применялись при попытках проведения биоочистки. Патент 3616204 раскрывает внесение в загрязненную почву культур микроорганизмов, про которые известно,что они обеспечивают деградацию нежелательных загрязнителей. Процедура, описанная Линном,связана с дополнительным введением питательных добавок для увеличения эффективности биоочистки почвы. Патент 5100455 раскрывает применение природной микрофлоры и фауны в 2 сочетании с гумусными субстратами для биологической обработки загрязнителей почвы,включая углеводороды, ассоциированные с нефтью. Патент 4849360 раскрывает биореактор для обработки загрязненной нефтью почвы, в котором для облегчения процесса биоочистки через загрязненную почву продувается воздух. В биореакторе применяют природную микрофлору, к которой добавляют фосфорное и азотное питание. Хотя известны различные бактерии,обеспечивающие деградацию ПАУ, которые применялись в различных вариантах для коррекции,с точки зрения специалиста существует потребность в идентификации новых и полезных штаммов,имеющих новые свойства, которые эффективны для обеспечения быстрой деградации нефтяных загрязнителей. Кроме того, сохраняется потребность в усовершенствованиях,направленных на биокоррекцию уровня металлов, таких как снижении биоаккумуляции металлов,представленных в загрязненных почвах,содержащих металлы в потоках отходов и материалах для промышленных процессов. Раскрытие изобретении Настоящее изобретение относится к способам деградации нефтяных загрязнителей, включая ПАУ. Дополнительно настоящее изобретение относится к способу биообработки, который улучшает удаление тяжелых металлов из почвы. Настоящее изобретение применяет изолированные и очищенные бактериальные штаммы изолятов бактерий в области,где происходит очистка нефти. Определенные изоляты обладают дополнительной способностью производить полезные биосурфактанты. Один из аспектов, по меньшей мере, одного из воплощений настоящего изобретения заключается в обеспечении изолированных бактериальных штаммов, которые производят биосурфактанты в условиях биокоррекциии. Природная способность изолированных и очищенных бактериальных штаммов производить биосурфактанты вносит вклад в способность бактерий обеспечивать биоочистку. Биосурфактанты обеспечивают повышенную растворимость ПАУ и доступ бактерий к ПАУ, увеличивая, таким образом,эффективность биоочистки,проводимой бактериальными штаммами. Виосурфактант может также снижать биоаккумуляцию Р в почве. Полагают также, что он полезен при биоочистке других загрязнителей-металлов, которые также отвечают на обработку сурфактантами. В дополнительном аспекте, по меньшей мере,одно из воплощений настоящего изобретения относится к изолированным и очищенным штаммам бактерий, у которых свойства, обеспечиваемые производимыми ими сурфактантами, вносят вклад в усиление солюбилизации нефти и нефтепродуктов. Биосурфактанты увеличивают солюбилизацию нефтепродуктов, что облегчает их отмывку водой или удаление нефтепродуктов, ассоциированных с агрегатами биосурфактантов, такими как мицеллы или подобные структуры. Кроме того, 24163 биосурфактанты увеличивают бионакопление нефтепродуктов, что усиливает способность микробов обеспечивать деградацию загрязнителей. Повышенная биоаккумуляция полезна для изолированных и очищенных штаммов, а также для других полезных микроорганизмов, представленных в загрязненном субстрате. Еще одним аспектом, по меньшей мере, одного из воплощений настоящего изобретения является обеспечение штаммов изолированных и очищенных бактерий, которые обеспечивают деградацию 2-х или 3-х кольцевых низкомолекулярных ПАУ, таких как нафталин, фенантрен, фторантен вместе с промежуточными продуктами деградации ПАУ. Дополнительный аспект, по меньшей мере,одного из воплощений настоящего изобретения заключается в обеспечении штамма изолированных очищенных бактерий,который обеспечивает деградацию 4-х кольцевых ПАУ и ПАУ с большим молекулярным весом, включая пирен и фторантен. Обычно 4-х кольцевые ПАУ и ПАУ с большим молекулярным весом значительно более устойчивы в окружающей среде и резистентны по отношению к деградации по сравнению с низкомолекулярными ПАУ. Соответственно, способность обеспечивать штаммы бактерий,которые осуществляют деградацию 4-х кольцевых ПАУ и ПАУ с большим молекулярным весом, является весьма значительной. Промежуточные продукты деградации ПАУ могут дополнительно функционировать как хелаторы металлов. Эта хелирующая активность или образование комплексов металлов может содействовать биокоррекции отходов, содержащих как ПАУ, так и металлы. Дополнительно, по меньшей мере, некоторые из штаммов бактерий,идентифицированных здесь,обладают способностью обеспечивать деградацию нескольких различных типов ПАУ (включая 2-х, 3-х и 4-х кольцевые РАН) в дополнении к способности обеспечивать деградацию фенантрена. Еще одним аспектом, по меньшей мере, одного из воплощений настоящего изобретения является обеспечение штаммов изолированных и очищенных бактерий, обладающих поверхностно-активными свойствами, полезными для удаления металлов из загрязненной почвы и субстратов. Изолированные и очищенные штаммы бактерий производят мономеры сурфактантов. Биосурфактантные мономеры производятся в достаточных количествах,чтобы мономеры агрегировали с образованием трехмерных структур, включая мицеллы. Мицеллы биосурфактантов имеют полярные головки, которые в почве связывают ионы металлов. Мицеллы,включающие ионы металлов, могут быть удалены в виде водной суспензии или путем промывки,понижая, таким образом, содержание металла в субстрате. Полученные удаленные металлы,содержащиеся в мицеллах биосурфактантов, можно затем более легко отделить и сконцентрировать для эффективного удаления или хранения. Еще одним аспектом, по меньшей мере, одного из воплощений настоящего изобретения является обеспечение изолированных и очищенных культур бактерий, обладающих способностью обеспечивать деградацию широкого ряда различных типов ПАУ в условиях биоочистки. Еще одним аспектом, по меньшей мере, одного из воплощений настоящего изобретения является обеспечение изолированных и очищенных бактерий,которые производят биосурфактанты в сложных условиях, изолированные штаммы обладающие дополнительной способностью деградировать ПАУ в условиях биоочистки. Еще одним аспектом, по меньшей мере, одного из воплощений настоящего изобретения является обеспечение изолированных и очищенных штаммов бактерий, обладающих способностью вызывать снижение содержания общих углеводородов нефти(ОУН). Кроме того, способность определенных изолятов производить биосурфактанты в условиях биоочистки увеличивает биоаккумуляцию ОУН для других микроорганизмов, которые могут быть представлены в загрязненной почве или других продуктах отходов. Еще одним аспектом, по меньшей мере, одного из воплощений настоящего изобретения является обеспечение изолированных и очищенных штаммов бактерий, обладающих способностью деградировать ПАУ совместно со способностью производить биосурфактанты в условиях проведения биоочистки. Еще один аспект, по меньшей мере, одного из воплощений настоящего изобретения позволяет изолированным и очищенным штаммам бактерий иметь способность вызывать общее снижение бионакопления свинца, который может быть представлен в почве, или свинца, содержащегося в сточных водах. Биосурфактант, производимый одним или более изолятами, может применяться в комбинации с неорганическими фосфатами для снижения бионакоплепия свинца в загрязненном субстрате, таком как почва. Другой аспект, по меньшей мере, одного из воплощений настоящего изобретения включает способ биоочистки нефтяных загрязняющих агентов из загрязненной окружающей среды, включающий стадии обеспечения субстрата, загрязненного нефтепродуктами, введение в этот загрязненный субстрат, по меньшей мере, одного бактериального изолята, который метаболизирует компоненты нефтяного загрязнения и который дополнительно производит биосурфактант, и обеспечение на время обработки адекватных питательных веществ,достаточных для того,чтобы нефтяной загрязняющий агент, утилизируемый изолятом, был деградирован до конечной концентрации 100 рр ОУН или менее. Эти и другие аспекты настоящего изобретения обеспечиваются биологически чистыми бактериальными штаммами для биоочистки нефтепродуктов и ПАУ, включая изоляты,выбранные из изолятов, идентифицированных в таблице 2. Эти и другие особенности, аспекты и преимущества настоящего изобретения станут лучше понятными со ссылкой на следующее описание и приложенную формулу изобретения. 3 24163 Краткое описание рисунков Фигура 1 демонстрирует график, показывающий биоаккумуляцию свинца при введении различных добавок и биологических изолятов в отношении сильно загрязненной почвы (900 мг /кг почвы). Фигура 2 представляет собой график,показывающий изменения в общей органической материи в образцах почвы после проведения обработки в соответствии с протоколом. Осуществление изобретения Полное и достаточное для воспроизведения раскрытие настоящего изобретения, включая его наилучшие воплощения, для специалиста в данной области представлено в более практическом виде далее в тексте описания. Будут в деталях сделаны ссылки на воплощения изобретения, один или более примеров, которые приведены ниже. Каждый пример сопровождается путем представления разъяснений изобретения,не ограничивая изобретение. Фактически для специалиста будет очевидным, что в настоящем изобретении могут быть сделаны различные модификации и вариации без отхода от рамок и духа изобретения. Например,особенности, описанные как часть одного воплощения, могут применяться в другом воплощении, давая еще одно воплощение. Таким образом,подразумевается,что настоящее изобретение покрывает такие модификации и вариации,которые вытекают из рамок приложенной формулы изобретения и эквивалентов ее пунктов. Другие цели, особенности и аспекты настоящего изобретения раскрыты в следующем далее подробном описании. Обычному специалисту понятно, что настоящее обсуждение является описанием только примерных воплощений, и не имеет намерения ограничить широкие аспекты настоящего изобретения, широкие аспекты которого воплощены в конструкции примеров. Настоящее изобретение направлено на бактериальные изоляты, полученные на столетнем нефтеочистительном заводе Чеховице в Польше. Старые отложения нефтеочистительного завода характеризуются кислыми свойствами (рН 2) и содержат высокие концентрации ПАУ вместе с тяжелыми металлами. Дополнительно отложения характеризуются присутствием отработанных катализаторов, асфальтов, диатомовой земли,силикагеля, легкой угольной золы, вес эти компоненты содержат высокий фоновый уровень тяжелых металлов (//), которые были ранее захоронены в этом участке. Участок сбора находится в области, имеющей приблизительно 120000 тонн отходов,хранящихся в необлицованных отстойниках, глубиной 3 метра и занимающих площадь 3,8 гектара. Всего из осадков с минимально кислой средой(рН 4),контактирующих с нафталиновыми парами, было изолиривано 45 видов бактерий, 68 видов грибов и 7 видов дрожжей. Наборы изолятов были охарактеризованы в соответствии с традиционными таксономическими критериями, тестоми путем анализарРНК генов. Бактериальные группы включали 4. Дополнительную характеристику изолятов можно видеть в информации,обеспечиваемой таблицами 1 и 2. Протоколы тестас применением минимальных факторов питания вместе с различными интересующими органическими субстратами описаны в ссылке на публикацию,18329347, 1993, которая включена сюда путем ссылки. С применением основной ростовой среды,содержащей кислые минеральные соли нафталиновых паров, всего было получено 45 видов бактерий, 68 видов грибов и 7 видов дрожжей. Не останавливаясь отдельно, нужно отметить, что многие из изолятов обладали способностью метаболизировать катехин и бактериальные изоляты характеризовались способностью деградировать ПАУ. Дополнительно необходимо отметить, что изоляты и очищенные организмы, обладавшие способностью деградировать ПАУ,характеризовались также способностью деградировать различные нефтяные загрязнители,ассоциированные с определением ОУН. Как показано в таблице 1, наблюдалось, что три вида бактерий, названных 1, ВР 20 и, которые соответствуют изолятам 1-3 в таблице 2, при росте на минимальной среде,содержащей нафталин, фенантрен или фторантрен,производят сурфактант. Наблюдалось также, что девять дополнительных штаммов,идентифицированных в таблице 1, деградируют ряд ПАУ,показывая,что изоляты имеют каталитическую или энзиматическую способность деградировать загрязняющие агенты,хотя дополнительные изоляты не демонстрировали способности производить сурфактант. Идентифицированные выше бактериальные штаммы растут и поддерживаются на чашках с 1 пептоном, триптиказой, дрожжевым экстрактом,глюкозой . Бактерии росли в аэробной среде при 30 С и поддерживались на минимальной среде при 4 С или при длительном хранении в замороженной среде при -70 С или в жидком азоте(-196 С). Идентификация бактерий была проведена с применением протоколов определения рДНК или метиловых эфиров жирных кислот , как изложено в публикации,51221-271, (1987),которая включена сюда путем ссылки. Выделенные изоляты 1-12, идентифицированные в таблице 2,были задепонированы (сданы на хранение) в Американской коллекции типов культур (Аеса, ), , ) 3 октября 2003 года и имеют указанные номера АТСС. Формы депонирования (паспорт штамма),сопровождающие каждый из задепонированных изолятов, как утверждено АТСС, включены сюда путем ссылки. 16186 Проанализированы в соответствии со следующими характеристиками 8 изолят индиго мета расщеплениеРНЕАСЕИзолированы в парах нафталина Идентифицированные выше изоляты бактерий были установлены как отдельные виды. Каждый из идентифицированных изолятов обладал 24163 способностью деградировать ПАУ и демонстрировал также способность снижать уровень ОУН в почве. Кроме того, определенные изоляты обладали способностью производить биосурфактант. Полагаем, что каждый изолят является оригинальным,что основано на характеристике рДНК и вариациях, отмеченных в таблицах 1 и 2 в отношении характеристик их физиологического роста. Все три изолята 1-3 АТСС РТА 5580) демонстрировали способность производить биосурфактант,образование которого было отмечено в условиях культивирования. Раствор биосурфактанта для каждого изолята был проанализирован, и было показано, что он обладает способностью изменять поверхностное натяжение,что согласуется со свойствами сурфактантов. Все изоляты 4-12 демонстрировали способность обеспечивать биодеградацию различных ПАУ(таблица 1). Как видно из примера 1 ниже,применение консорциума из 12 изолятов,идентифицированных в таблице 2, для устранения углеводородов нефти, содержащихся в почве, при изучении результатов очистки в биореакторе,привело к появлению видимых количеств биосурфактантов, производимых в условиях биоочистки. Полагают, что способность определенных биоизолятов производить биореактанты усиливает процесс очистки с помощью нескольких различных механизмов. Продуцирование биосурфактанта увеличивает биологическую пригодность ПАУ и других гидрофобных соединений нефти. Повышенная биологическая пригодность включает способность производимого сурфактанта солюбилизировать и делать доступным для изолята ПАУ и другие соединения нефти. Вследствие этого способность изолятов производить сурфактанты увеличивает эффективность изолятов в отношении их способности деградировать и метаболизировать ПАУ. Как отмечено в примере 1, консорциум примененных изолятов приводит к видимым количествам сурфактанта, производимого в почве. Известно, что биосурфактанты в основном имеют химическую структуру, согласующуюся с наличием в молекуле полярной головы и неполярного хвоста. В водных растворах биосурфактанты вызывают снижение поверхностного натяжения жидкости и облегчают образование эмульсии между жидкостями различной степени полярности. Эта способность содействует обеспечению полезности биосурфактантов в гидрофобных, неполярных областях хвоста биосурфактантов, и мицеллы из биосурфактантов могут улавливать масла и другие соединения нефти. Уловленные таким образом масла и соединения нефти накапливаются в больших количествах бактериями для биодеградации. Дополнительно мицеллы,включающие уловленные масла и соединения 6 нефти, могут периодически удаляться или вымываться из системы, обеспечивая, таким образом, способность дополнительно изолировать и отделять соединения нефти из почвенного субстрата. Дополнительно образованные биосурфактантами мицеллы способствуют удалению из почвы металлов. Гидрофильные полярные группы мицелл будут связывать металл и ионы металла,представленные в почве. После связывания растворимая природа мицелл позволяет собрать мицеллы и связанные с ними металлы. Будучи собранным, концентрированный объем мицелл и содержащихся металлов может быть дополнительно обработан для отделения металлов от биосурфактанта. Кроме того, было обнаружено, что выбранные изоляты,которые производят биосурфактанты, могут применяться для снижения бионакопления определенных металлов, таких как свинец, представленных в почве. Для некоторых очисток сурфактанты не применяются для удаления загрязнителя,но обеспечивают способ долговременной стабилизации загрязненного участка. Стабилизация включает снижение бионакопления свинца с предотвращением миграции свинца в поверхностном стоке к прилегающим незагрязненным участкам и грунтовым водам. Пример 1 Был сконструирован мобильный биореактор, в который было заложено четыре тонны почвы,загрязненной низкими концентрациями цезия-137 и 26000 рр углеводородов нефти. Загрязненная почва была сточным материалом, полученным из(, ). Источник и пополнение нефтепродуктов неизвестны, но полагают,что они являются смесью использованного моторного масла и дизельного топлива. Почва была улучшена путем добавления 7 наполнителя в виде старого компоста. Было добавлено три литра культуры каждого изолята в логарифмической фазе роста и распределено в четырех тоннах смешанной загрязненной почвы. Биореактор был оборудован вторым рельефным перфорированным настилом, имеющим нижние питающие линии аэрации, которые обеспечивали непрерывное поступление воздуха из окружающей среды в биореактор. Дополнительно периодически вводили питательные добавки азота, калия и фосфора (10-10-10) для усиления биологической активности в биореакторе. Были прикреплены входящие и выходящие соединения для воды. Компрессор для воздуха, вакуумный насос и насос для жидкости применялись для контроля и регуляции потоков воздуха и воды через биореактор и контроля влажности внутри биореактора. Присутствие низкого уровня цезия-137 ограничивало количество и типы способов регистрации состояния внутри биореактора и требовало применения фильтрования с высокоэффективной задержкой частиц на входящем соединении для воды. Периодически проводимые 24163 измерения уровня СО 2 показали, что в течение пяти месяцев деградации подвергся 121 фунт нефтепродуктов. На основе измерения СО 2 было приблизительно подсчитано, что за пятимесячный интервал в результате процесса биоочистки из почвы было удалено 16000 мг/кг нефтяных загрязнений. Было показано, что в 4 тонном объеме загрязненной почвы после 20 месяцев обработки ОУН снизились до 45 рр. Способность изолятов деградировать нефть и другие углеводородные продукты при производстве биосурфактантов дает огромные преимущества, исходя из эффективности и универсальности (многосторонности) протоколов условий обработки. Например, полагают, что для почв, загрязненных исключительно нефтью и продуктами переработки нефти, настоящие изоляты могут применяться индивидуально или вместе,применяться с традиционными способами биоочистки для улучшения эффективности деградации. Как описано выше,действие биосурфактантов создает большую зону растворимости нефти для каждой индивидуальной бактерии. В результате имеет место большая пригодность нефтепродуктов для биодеградации. Кроме того, изоляты образуют агрегатные колонии,биопленки и биоповерхности с частицами почвы,полагают,что сурфактанты существенно увеличивают бионакопление нефтяных субстратов для бактериальных агрегатов. В то же время сурфактанты также увеличивают солюбилизацию тяжелых металлов,которые могут быть представлены в почве, и обеспечивают способность снижать концентрацию тяжелых металлов путем удаления производимых сурфактантов. Как видно из примера 1, консорциум изолятов обеспечивает процесс биоочистки, который может привести к значительному снижению содержания нефти в загрязненной почве. Это свойство особенно полезно в отношении сформулированной стратегии размещения смешанных отходов, в которых загрязненная нефтью почва и материал с низкой радиоактивностью представлены совместно. В настоящее время загрязненная почва с низким уровнем радиоактивных отходов и имеющая дополнительные загрязнения нефтью должна иметь нижний регулируемый предел в 1 рр для ВТЕХ(бензол, толуол, этилбензол, ксилен) и 100 рр для ОУН до того, как почва может быть классифицирована и размещена как отходы с низким уровнем радиоактивности. Стоимость хранения почвы,которая соответствует определению отхода с низким уровнем радиоактивности, составляет приблизительно 262 США за кубический метр в год. В отличие от этого почва, содержащая низкий уровень радиоактивного материала и загрязненная нефтью, при превышении регулируемого предела должна храниться как смешанные отходы. Стоимость хранения почвы в виде смешанных отходов составляет приблизительно 10,165 США за кубический метр почвы в год на основе только начальной стоимости. Способность обрабатывать смешанные почвенные отходы и таким образом удалять существенные уровни нефтяных загрязнений имеет очень большое значение. Удаление достаточного количества нефтяных зшрязнений из смешанных почвенных отходов позволяет хранить смешанные почвенные отходы как отходы с низким уровнем радиоактивности. Результирующая стоимость оказывается в 38 раз ниже, чем стоимость хранения смешанных отходов. Применение настоящих инокулянтов имеет дополнительные преимущества в том, что в отличие от ранее применяемых способов объем веществ,добавляемых к почве для очистки, поддерживается на минимальном уровне. Поддержание объема этих добавок на минимальном уровне снижает конечную стоимость хранения,особенно для почв,содержащих низкий уровень радиоактивности. Полагают, что настоящие изоляты полезны для проектов очистки. Консорциум изолятов можно добавить к загрязненной почве с применением любого ряда традиционных технологий. Если необходимо, питательные добавки вместе с кислородом в любой физической или химической форме облегчают биоочистительную активность. Присущая изолятам способность деградировать ПАУ, а также заданная способность деградировать углеводороды нефти при процессах биоочисткис применением изолятов является большим преимуществом. Дополнительно способность определенных изолятов производить сурфактант (биосурфактант) во время условий почвенного роста делает применение определенных изолятов более выгодным. Как отмечалось,биосурфактант усиливает способность физического улавливания нефтепродуктов и тяжелых металлов,обеспечивая также повышенную солюбилизацию и доступ углеводородов к бактериальным изолятам и природным микроорганизмам, присутствующим в почве. Применение биосурфактантов может дать хорошие результаты в различных условиях загрязнения субстрата. К примеру, специалисту известно, что биосурфактанты обладают полезными свойствами образовывать комплексы с металлами,которые могут снизить токсичность металлов,позволяя в то же время усилить биодеградацию других отходов в участках, загрязненных органическими и металлическими загрязнителями. Одна такая публикация, озаглавленная,.,, октябрь 2000, стр. 4585-4588, которая включена сюда путем ссылки, описывает способность биосурфактантов снижать токсичность металлов в загрязненных системах, имеющих как органические, так и металлические загрязняющие агенты. В дополнительной публикации, . ,опубликованной в,2000, 93, стр. 915-929, которая включена сюда путем ссылки, дан полезный обзор роли сурфактантов в применении для очистки почвы. В подходящих 7 24163 условиях биосурфактанты могут обеспечивать важные преимущества в отношении солюбилизации органических соединений, деградации органики,солюбилизации металлов и их изоляции. Определенные изоляты, раскрытые здесь,продемонстрировали способность снижать биоаккумуляцию свинца в загрязненной почве. Загрязнение почвы свинцом может иметь место в результате различных активностей, включая разработки месторождений, присутствия красок на основе свинца, орудий на линиях стрельбы,загрязнений из добавок к бензину и нефти, центров восстановления свинцовых батарей и остатки взрывчатых веществ на основе свинца. Присутствие свинца вызывает многочисленные расстройства в нервной и репродуктивной системах человека. Свинец обычно попадает в организм человека путем вдыхания или проглатывания пыли, содержащей свинец. Известно, что почвы, содержащие свинец, могут быть обработаны с применением веществ,улучшающих почву, для снижения биоаккумуляции свинца. Некоторые такие добавки включают апатиты,и другие материалы, содержащие фосфат кальция. Известно, что апатиты связывают свинец и другие металлы в почве, снижая, таким образом, способность свинца к миграции. Связывание снижает также биоаккумуляцию свинца. Избранные сурфактанты также могут применяться для снижения бионакопления свинца,что продемонстрировано с изолятом 3. Была проведена оценка изолята 1 () и изолята 3 ( ) с целью выяснения, можно ли получить благоприятное снижение биоакккумуляции свинца путем включения в почву, содержащую свинец, вместе с другими добавками изолятов, производящих биосурфактант. Почва, загрязненная свинцом, была получена из небольшого тира для стрельбы, где свинцовые пули накаливались в почве в течение ряда лет. 50 г образцов загрязненной почвы было смешано с тремя различными добавками в виде фосфата кальция. Эти добавки фосфата кальция включали природный горный фосфат кальция из Северной Каролины (США), обозначаемый здесь как , природный горный фосфат кальция из Флориды (США), обозначаемый здесь как , и биологический апатит, полученный из молотых костей рыб, обозначаемый здесь как ВА. К образцам почвы, загрязненной свинцом, было добавлено и 10 и 5 по весу ,и ВА. Дополнительно определенные улучшенные образцы почвы были обработаны путем введения 5 мл образцов изолята номер 1,, в 1 питательном бульоне . Плотность изолята составляла 3,11 Е 08 клеток на мл. Дополнительные образцы были обработаны также изолятом номер 3, , с использованием 5 мл добавки с плотностью 3,43 Е 08 клеток на мл образца для микробной добавки, включающей 1 стерильный бульон . Загрязненные образцы почвы и различные добавки и культуры смешивали в запечатанных 8 контейнерах, которые были соединены трубками с респирометром, ОН) для определения скоростей метаболизма, включая потребление О 2 и прирост СО 2. Плотность микробной культуры была определена путем традиционного метода пластинчатого посева для определения колоний и плотности образцов. Как видно из результатов, представленных на фиг. 1, добавление изолята 3 приводит к значительному снижению биоаккумуляции свинца,определенному благодаря токсическим характеристикам процедуры выщелачивания(/ТХПВ) с применением протокола,идентифицированного в Агентстве защиты окружающей среды США, метод 6010. Добавки микробов вызывали значительное снижение биоаккумуляции свинца, когда применялись с 5 добавкамиили ВА к почве. Полагают, что низкая цена ВА продукта и его единообразие приведет к тому, что применение ВА в сочетании с изолятом 3 или комбинаций этого вызовет превосходное снижение биоаккумуляции свинца в почве. Сочетание ВА с природно производимыми сурфактантами бактерий изолята 3 вызывает другие значительные улучшения в образцах загрязненной почвы. Отмечено, что увеличение скорости метаболизма,измеренное по потреблению кислорода и продукции окиси углерода,увеличивается с ростом плотности микробов. Как видно на фиг. 2, общий органический материал значительно увеличивается через 114 часов инкубации образцов с применением изолята .в сочетании с ВА с 1 и 5 уровнями включения. Увеличение общей органической материи отражает увеличение общей популяции микробов, которое может относиться к увеличению запасов биосурфактантов. Повышенная пригодность микропитания приводит к увеличению биологической активности,приводящей к увеличению количества органической материи. Хотя большинство значительных результатов можно было видеть с ВА в сочетании со штаммом изолята. , различные комбинации других апатитов позволяют предполагать, что для увеличения общей микробной активности могут быть применены один или более изолятов. Хотя отдельно не сообщалось, отмечено, что увеличение органической материи, как показано на фиг. 2, коррелирует со значительным увеличением рН почвы, потребления О 2, продуцированием СО 2, а также снижением биоаккумуляции свинца, как отмечено на фиг. 1. Полагают, что применение изолятов, описанное выше, вызывает уменьшение биоаккумуляции свинца, обусловленное, по меньшей мере, частично,способностью изолятов производить сурфактант. Полагают,что биосурфактанты усиливают природные тенденции апатита в отношении увеличения скорости метаболизма, доступности питательных веществ и благоприятного увеличения рН и снижения биоаккумуляции свинца. Как 24163 описано предварительно,биосурфактанты вызывают благоприятные изменения условий в почве, которые улучшают условия питания и пригодность микронутриентов для микроорганизмов. Увеличение биологической активности и ассоциированное с этим увеличение биомассы в почве дополнительно снижают биоаккумуляцию свинца. Активность .в снижении биоаккумуляции почвенного свинца является синергетической с ВА при его концентрации 5. Экспоненциальное увеличение скорости дыхания, плотности микробов и увеличение биомассы является ясным свидетельством того, что активность относится к специфической биологической активности. Как отмечено на фиг. 1, различные сурфактанты оказывают различное действие, когда они применяются с любым конкретным апатитом,используемым как неорганическая добавка. Благодаря рутинным экспериментам можно оценить различные изоляты для определения комбинаций,приносящих желаемые улучшения в биоаккумуляции свинца в отношении данных почвенных условий, выбранных апатитов и/или других добавок, применяемых в процедуре биоочистки. Может быть отобрано большинство полезных комбинаций добавок и изолятов для получения желаемого снижения биоаккумуляции свинца. Как описано предварительно в этой заявке,изоляты являются полезными для снижения уровня ПАУ, а также облегчения удаления и/или связывания минеральных ионов из загрязненных почв и субстратов. Соответственно,для загрязненных почв и сточных вод, имеющих различные загрязнения, включая ПАУ, ионы металлов, другие металлы, такие как свинец,применение одного или более настоящих изолятов,включая изоляты, производящие биосурфактанты,может эффективно удалять множественные загрязняющие агенты в пределах данного участка. В то время как приведенные примеры были даны в контексте очистки высоко загрязненной почвы(900 мг /кг почвы), полагают, что выгодность индивидуальных изолятов или комбинаций изолятов не ограничивается попытками очистки почвы мероприятиями. К примеру, полагают, что изоляты, производящие биосурфактанты, могут применяться как часть способов обработки сточных вод шахт или заводов, где производятся тяжелые металлы, ионы металлов, свинец, медь, кадмий,цинк, другие металлы и другие загрязнители. Многие участки (к примеру, свалки и заброшенные промышленные объекты) характеризуются загрязнением свинцом в низкой концентрации(1-10 мгР/кг почвы), что является еще здоровым относительно возможных токсикологических последствий и будущего использования земли. Применение инокулянтов, которые включаются в исходные сточные воды и которые содержат один или более изолятов, может вызвать снижение объема загрязнителей в сточных водах и интродуцировать популяцию микробной флоры, которая может сохраняться как часть долговременного протокола обработки производимых и/или хранимых отходов. Например,отходы рудников могут быть первоначально обработаны для снижения определенных загрязняющих агентов до закладки в место хранения. После этого присутствие изолятов в отходах рудников может быть использовано преимущественно в последующей обработке,предназначенной для стимулирования полезной биологической активности, так что вызывается существенное снижение и/или стабилизация загрязнителей, представленных в сточных водах. Полагают, что подобные результаты могут применяться в различных промышленных отходах,где изоляты могут использоваться как часть способа биологической обработки для начального снижения уровня загрязнителей и обеспечения микробной популяции, которая может применяться как часть долговременной обработки для хранения и захоронения жидких отходов. Хотя предпочтительные воплощения изобретения описаны с применением специфических терминов, устройств и способов,такое описание сделано только для иллюстративных целей. Используемые слова являются словами описания, а не ограничениями. Понятно, что обычными специалистами могут быть сделаны изменения и вариации без устранения духа или выхода за рамки настоящего изобретения. Кроме того, должно быть понятно, что аспекты различных воплощений могут быть взаимозаменяемыми, как в целом, так и в части. Таким образом, дух и рамки приложенной формулы изобретения не должны быть ограничены описанием предпочтительных версий, включенных сюда. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Биологически чистый бактериальный штамм для биоочистки от углеводородов нефти,включающий изолят, выбранный из группы,состоящей из штаммов с номерами АТСС РТА-5570,РТА-5571, РТА-5572, РТА-5573, РТА-5574, РТА 5575, РТА-5576, РТА-5577, РТА-5578, РТА-5579,РТА-5580, РТА-5581 и их комбинации. 2. Способ биоочистки с устранением нефтяных загрязнителей из почвы, отличающийся тем, что он включает следующие стадии обеспечение запаса загрязненной почвы,имеющей нефтяной загрязняющий агент введение в названный запас загрязненной почвы,по меньшей мере, одного бактериального изолята по п.1,который метаболизирует компоненты нефтяного загрязнения и который дополнительно производит биосурфактант и обеспечение адекватными питательными веществами во время обработки, достаточного для того, чтобы изолят, утилизирующий загрязнитель,деградировал нефтяное загрязнение. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что названная концентрация нефтяного загрязнителя в 9 24163 названной почве составляет менее 100 рр общих углеводородов нефти после обработки, по меньшей мере, одним бактериальным изолятом. 4. Способ по п.2, отличающийся тем, что названный запас загрязненной почвы дополнительно содержит низкий уровень радиоактивных отходов. 5. Способ по п.2, отличающийся тем, что названная стадия введения изолята дополнительно включает добавление изолята, выбранного из группы, состоящей из штаммов с номерами АТСС РТА-5579, РТА-5580 и РТА-5581, и их комбинаций. 6. Способ по п.2, отличающийся тем, что названный нефтяной загрязнитель включает полиароматические углеводороды. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что названные полиароматические углеводороды дополнительно включают полиароматические углеводороды, выбранные из группы, состоящей из 2-кольцевых, 3-х кольцевых и 4-х кольцевых полиароматических углеводородов и их комбинаций. 8. Способ обработки смешанных отходов почвы, загрязненной тяжелыми металлами и нефтяными загрязнителями, отличающийся тем,что он включает стадии обеспечение запаса загрязненной почвы,включающей металлический загрязнитель и нефтяной загрязнитель введение в названный запас загрязненной почвы,по меньшей мере, одного бактериального изолята по п. 1, который метаболизирует компоненты нефтяного загрязнения и который дополнительно производит биосурфактант и периодическое удаление части произведенного биосурфактанта из названного запаса почвы,названный биосурфактант включает либо часть названных тяжелых металлов, либо названный нефтяной загрязнитель и повторение названной стадии удаления части названного сурфактанта, пока концентрация названных тяжелых металлов не снизится до контрольного показателя. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что названная стадия введения, по меньшей мере,одного бактериального изолята дополнительно включает добавление изолята, выбранного из группы, состоящей из штаммов с номерами АТСС РТА-5579, РТА-5580 и РТА-5581, и их комбинаций. 10. Способ по п.8, отличающийся тем, что названный нефтяной загрязнитель дополнительно включает полиароматические углеводороды. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что названные полиароматические углеводороды дополнительно включают полиароматические углеводороды, выбранные из группы, состоящей из 2-кольцевых, 3-х кольцевых и 4-х кольцевых полиароматических углеводородов и их комбинаций. 12. Способ обработки почвы, включающей материал с низким уровнем радиации и углеводороды нефти, отличающийся тем, что он включает стадии обеспечение запаса загрязненной почвы,включающей радиоактивные отходы и углеводороды нефти введение в названный запас загрязненной почвы,по меньшей мере, одного бактериального изолята,который метаболизирует компоненты нефтяного загрязнения и который выбран из группы,состоящей из штаммов с номерами АТСС РТА-5570,РТА-5571, РТА-5572, РТА-5573, РТА-5574, РТА 5575, РТА-5576, РТА-5577, РТА-5578, РТА-5579,РТА-5580, РТА-5581 и их комбинации, которые метаболизируют компонент нефтяного загрязнения и обработка названного запаса загрязненной почвы до тех пор, пока концентрация названного нефтяного загрязнителя не станет меньше, чем примерно 100 рр общих углеводородов нефти. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что названный, по меньшей мере, один бактериальный изолят дополнительно включает изолят, выбранный из группы, состоящей из штаммов с номерами АТСС РТА-5579, РТА-5580 и РТА-5581, и их комбинаций. 14. Способ по п.12, отличающийся тем, что названный, по меньшей мере, один бактериальный изолят в условиях биоочистки дополнительно производит сурфактант. 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что включает дополнительную стадию периодического удаления части произведенного сурфактанта из названного запаса загрязненной почвы. 16. Способ обработки почвы, загрязненной свинцом, так что снижается биоаккумуляция свинца, отличающийся тем, что он включает стадии обеспечение запаса загрязненной свинцом почвы обеспечение добавок к почве в виде примерно 15 или больше биологического апатита дополнительное добавление к названной загрязненной почве инокулянта, выбранного из группы, состоящей из штаммов с номерами АТСС РТА-5579, РТА-5580 и РТА-5581, и их комбинаций где названная загрязненная почва после этого характеризуется пониженным бионакоплением свинца.