Способ получения биопрепарата против вредителей сельскохозяйственных культур

-07/КБ энтомопатогенной бактерии. , против вредителей,например гусениц яблонной моли,сельскохозяйственных культур. Задачей заявляемого изобретения является получение высокоэффективного биопрепарата на основе экологически безопасной бактерии из группыпротив гусениц яблонной моли и сохраняющего свою энтомоцидную активность при длительном хранении. Технический результат достигается тем, что высокоэффективный биопрепарат получают на основе экологически безопасной бактерии из группы, пригодной для создания высокоэффективного энтомоцидного препарата в жидкой форме против гусениц яблонной моли и сохраняющего свою энтомоцидную активность при длительном хранении.(72) Сагитов Абай Оразулы Дуйсембеков Бахытжан Алишерович Успанов Алибек Маратович Макаров Евгений Михайлович Баймагамбетов Едилбай Жакенович Адилханкызы Айнура(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский институт защиты и карантина растений(56) А.С. Воловик, В.М. Глез, А.М. Замотаев и др. Защита картофеля от вредителей и сорняков,Справочник, М. Агропромиздат, 1989 г(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ПРОТИВ ВРЕДИТЕЛЕЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР(57) Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности,к получению биопрепарата на основе штамма Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности, к получению биопрепарата на основе штамма энтомопатогенной бактерии. , против вредителей сельскохозяйственных культур,например, гусениц яблонной моли. Известен способ получения препарата пиретроида (С.Л. Быховец. Весц. АН БССР, 4, 7477 (1987). Этот препарат оказывает эффективное действие на широкий круг вредителей, у него низкая токсичность на теплокровных, а относительно быстрый распад с образованием малотоксичных веществ обеспечивают широкое применение в народном хозяйстве. Известен способ получения биопрепарата из растительных экстрактов. Среди них дерево Ним, произрастающее в Южной Азии, считается наиболее перспективным. Выделенный из экстракта семян азадирахтин, относящийся к классу тетранортритерпеноидов, действует на 27 видов вредителей сельскохозяйственных культур.., .22, 3, 433-449 (1993). Однако это соединение является труднодоступным в наших условиях. Известен способ получения биопрепарата из грибана основе живых спор(А СССР 1396121, кл. А 01 63/00, 1983.) Основной недостаток указанного способа низкая активность токсичной фракции и низкий выход. Кроме того, препарат быстро теряет активность при хранении. Известен способ получения биопрепарата на основе штамма бактерийдля защиты сельскохозяйственных культур (Защита картофеля от вредителей и сорняков Справочник/ А.С. Воловик, В.М. Глез, А.М. Замотаев и др. М. Агропромиздат,1989). Данный препарат представляет собой суспензию бактерий с титром 3-5109 в культуральной жидкости без дополнительных компонентов. Недостатком является то, что очень короткий(2 недели) срок хранения. Задачей изобретения является получение высокоэффективного биопрепарата на основе экологически безопасной бактерии из группы, против гусениц яблонной моли и сохраняющего свою энтомоцидную активность при длительном хранении. Технический результат достигается тем, что высокоэффективный биопрепарат получают на основе экологически безопасной бактерии из группы, пригодной для создания высокоэффективного энтомоцидного препарата в жидкой форме против гусениц яблонной моли и сохраняющего свою энтомоцидную активность при длительном хранении. Это достигается тем, что в качестве средства для получения энтомоцидного препарата используют штамм -07/КБ. Штамм -07/КБ был выделен 2 из трупа погибшей гусеницы яблонной моли найденной в заброшенном яблоневом саду в Алматинской области и депонирован в 2009 году ДГП Республиканской коллекцией микроорганизмов. Паспорт на штамм и свидетельство о депонировании прилагаются. Идентифицирован согласно классификации.(1962, 1967, 1990). Штамм малотоксичен для теплокровных животных. Штамм растет на питательных дрожжеполисахаридных средах хранится на косяках МПА в пробирках при 4-5 С с периодическими пересевами один раз в 12 месяцев. Штамм -07/КБ перспективен в качестве средства для производства биопрепарата для защиты яблонь от гусениц яблонной моли. На основе этого штамма разработана технология производства нового биопрепарата. Получение препаративной формы Сначала в колбах(1 л) готовили дрожжеполисахаридную питательную среду следующего состава,Кукурузная мука 1,5-2,0 Кормовые дрожжи 3,0-3,5(4)2 НР 4 0,5-0,6 О 472 О 0,02-0,04 СаС 22 Н 2 О 0,15-0,20 Вода водопроводная до 100 мл. С помощью щелочи (10 ) довелисреды до 7,4-7,8. Потом эту питательную среду разлили по 30-50 мл в колбы Эрленмейера емкостью 750 мл и стерилизовали в течение 40 мин при 120122 С. После стерилизациисреды составлял 7,07,2. Подготовленную питательную среду охлаждали и засевали культурой штамма -07/КБ. Для засева среды в колбы служит споровая культура штамма -07/КБ, полученная смывом 510 мл физраствора в пробирку с культурой на скошенном агаре. Полученную взвесь с культурой штамма взбалтывали до получения гомогенной суспензии и вносили в колбы с подготовленной питательной средой из расчета 0,3-0,5 мл суспензии на 30-50 мл среды. Засеянные колбы помещали на качалку при 200-220 об/мин и 28-30 С на 56-72 ч до полного высыпания спор и кристаллов эндоксина(проверку осуществляли мироскопированием). Выращенную в колбах культуральную жидкость штамма использовали для засева среды в ферментерах. В качестве питательной среды для ферментера использована дрожжеполисахаридная среда того же состава, который был использован для получения культуральной жидкости в колбах, т.е. на основе кормовых дрожжей и кукурузной муки. При этом сначала в водопроводную воду,прогретую до 40 С, засыпали при постоянном перемешивании все остальные ингредиенты,полученную взвесь нагревали до 80 С и выдерживали в течение 30 мин, после чегодоводили до 7,8-8,0 и среду стерилизовали в течение 1 ч при 140 С. Простерилизованную питательную среду для ферментера охлаждали до 30-35 С и вносили в нее культуральную жидкость штамма -07/КБ, 31214 заранее выращенную в колбах, из расчета 0,7-1,0 культуральной жидкости от объема питательной среды в ферментере. В ферментере процесс культивирования проводили при следующих условиях- скорость вращения мешалки 200-220 об/мин- режим подачи воздуха с 0 до 12 ч- 0,2 возд / среды /мин с 12 до 24 ч - 0,5 возд /среды/мин с 24 до 42 ч - 0,8-1,0 возд / среды/мин с 42 ч - до окончания ферментации - 0,5 возд / среды /мин. То есть процесс ферментации проводили в условиях высокой аэрации и заканчивали при достижении содержания в полученном препарате 80-85 свободных спор и кристаллов эндотоксина при их соотношении 11. При этом титр штамма 07/КБ в полученном жидком препарате составлял не менее 3,2-3,9 млрд.спор/мл при отсутствии посторонней микрофлоры. Таким образом, была получена препаративная форма (ПФ) на основе штамма -07/КБ, представляющий собой жидкость,легко разбавляемую водой до необходимой рабочей концентрации, удобной для применения серийной опрыскивающей аппаратуры. Были проведены лабораторные и полевые испытания биологической активности наработанной препаративной формы на основе штамма 07/КБ против гусениц яблонной моли. Так, например, лабораторные определения энтомоцидной активности препарата на основе штамма -07/КБ проводили на гусеницах яблонной моли 2-3 возрастов. При этом корм(листья яблони) обрабатывали ПФ в разведениях 110 и 1100, обеспечивающим гибель тест-объекта от 72,5 до 100. В каждый вариант опыта сажали по 20 гусениц яблонной моли 2-го возраста(в четырехкратной повторности). Для сравнения в опытах при тех же условиях использовали препарат на основе штамма-продуцента отечественного биопрепарата А кбелек - 2127-3, при тех же концентрациях. В контроле корм обрабатывали водой. Учет гибели вредителя проводили в течение 5 суток. Таблица 1 Биологическая активность наработанной препаративной формы на основе штамма -07/КБ против гусениц яблонной моли 2-3 возрастов, лабораторные испытания Препаративная форма Как видно из таблицы, по результатам тестирования при титре спор 1108 на пятые сутки наработанная препаративная форма на основе штамма -07/КБ смертность вредителя составила 100, так же как и в эталонном 2127-3. При снижении титра спор/мл до 1 х 107 препаративная форма так же оказались высоковирулентной в отношении гусениц яблонной моли (более 70). Гибели в контроле не отмечалось. Так же оценка биологической активности наработанной препаративной формы была оценена и в полевых условиях. В качестве эталона так же был использован штамм продуцент А кбелек - 21273. Результаты представлены на фиг.1. Фиг.1 - Оценка биологической активности ПФ в полевых условиях в отношении гусениц яблонной моли, титр 1108 спор/мл. По проведенным испытаниям видно, что наработанные ПФ оказались высоковирулентными к данному вредителю. При инфекционной нагрузке препаративных форм на основе штаммов 07/КБ и 2127-3 гибель гусениц составила 70 и 75, соответственно, на пятые сутки после заражения гибель насекомых достигла 100. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения биопрепарата против вредителей сельскохозяйственных культур,включающий использование штамма,отличающийся тем, что в охлажденную до 3035 С простерилизованную питательную среду,состоящую из кукурузной муки 1,5-2,0, кормовых дрожжей 3,0-3,5, (4)2 4 0,5-0,6, 472 0,02-0,04, 222 0,15-0,20 и воды водопроводной 100 мл вносят культуральную жидкость на основе бактерий, из расчета 0,7-1,0 культуральной жидкости от объема питательной среды в ферментере, перемешивают при 200-220 об/мин и 28-30 С в течение 56-72 ч. до полного высыпания спор и кристаллов эндоксина, причем процесс ферментации проводят в условиях высокой аэрации и заканчивают при достижении содержания в полученном препарате 80-85 свободных спор и 3 кристаллов эндотоксина при их соотношении 11,при этом титрв полученном жидком препарате составляет не менее 3,2-3,9 млрд.спор/мл при отсутствии посторонней микрофлоры.