Способ ускоренной ПЦР-диагностики для определения патогенных штаммов лептоспир в продуктах животноводства

(51) 12 1/01 (2006.01) 01 33/569 (2006.01) 01 33/12 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к ветеринарносанитарной экспертизе и служит для выявления бактерий лептоспир из продуктов животноводства. Предложен способ выявления патогенных штаммовпри помощи ПЦР. Способ включает проведение ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами 53,3. Переносят продукт амплификации на гель и оценивают проведенную реакцию. Для постановки ПЦР используют суспензию из органов и тканей на стерильной дистиллированной воде без выделения ДНК. ПЦР проводят в 1 раунд. В случае положительной реакции синтезируется фрагмент,соответствующий размеру 474 п.н. Предложенное изобретение позволяет эффективно выявлять патогенных штаммовв продуктах животноводства.(72) Киркимбаева Жумагуль СлямбековнаБияшев Кадыр БияшевичЛозовицка Божена Сарсембаева Нуржан БилтебаевнаЕрмагамбетова Светлана Емлсовна Кузембекова Гульнур Бериковна(56) Квятовская А.Ю. Разработка автоматизированных методов ДНК - диагностики эшерихий и сальмонелл в объектах ветеринарносанитарного надзора. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М, 1998(54) СПОСОБ УСКОРЕННОЙ ПЦРДИАГНОСТИКИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ ШТАММОВ ЛЕПТОСПИР В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОВОДСТВА Изобретение относится к ветеринарносанитарной экспертизе и представляет собой новый способ выявления бактерий в мясе и мясопродуктах при забое животных и может быть использовано при бактериологических исследованиях паренхиматозных органов и тканей. При бактериологическом исследовании мяса и мясопродуктов требуется решение задач, связанных с определением общей микробной обсеменнности продукции, индикацией конкретных возбудителей инфекций и идентификацией микроорганизмов различных таксономических групп. Существующие методы микробиологического исследования мяса и мясопродуктов, изложенные в соответствующей нормативной документации (ГОСТ 21237-75 и др.),достаточно длительны и трудомки, требуют использования значительного количества дифференциальных питательных сред и вспомогательных. При ускоренном выявлении возбудителей с помощью различных иммунологических методов(например,иммуноферментный анализ) необходимо предварительно выделить чистую культуру и для повышения чувствительности провести обогащение материала. Кроме того,идентификация возбудителей с неясной этиологией связана с использованием большого количества иммунных тест-систем для разных микроорганизмов. В последние годы для обнаружения и идентификации микроорганизмов в различных объектах исследования стали успешно применяться методы генной диагностики(гибридизация нуклеиновых кислот, секвенирование нуклеотидных последовательностей,полимеразная цепная реакция - ПЦР). Эти методы позволяют проводить индикацию и идентификацию микроорганизмов с высокой специфичностью в присутствии сопутствующей микрофлоры и чувствительностью до единичных клеток (Мальков И.Г., Артюшин С.К.,Фомин Б.А., Коромыслов Г.Ф. Разработка метода идентификации микобактерий человеческого и бычьего видов с использованием ПЦР.// Молек. генетика микроб, вирусол., 1993. -2.- С. 3-9. М.Медицина Белоусова Р.В., Гончарова Т.М., Асеев Н.В. и др. Разработка способов и технических средств полевой индикации возбудителей инфекционных заболеваний животных на основе генных зондов. В кн. Вопросы ветеринарной биологии. М, 1994, с. 68-70.). Для идентификации бактерий и уточнения их таксономического положения применялся метод,основанный на определении уровня гомологии сравниваемых ДНК (Мальков И.Г., Артюшин С.К.,Фомин Б.А., Коромыслов Г.Ф. Разработка метода идентификации микобактерий человеческого и бычьего видов с использованием ПЦР.// Молек. генетика микроб, вирусол, 1993. -2.- С. 3-9. М.Медицина Светличкин В.В., Лысенко А.М.,Петров Н.Б. и др. Сравнение различных способов введения метки в ДНК микроорганизмов. Биологические науки, 1985, 6, с. 130-135 1. //,1998, . 66, 7, .3303-3310.). При этом было установлено, что степень генетического родства бактерий дискретна, а уровень гомологии ДНК соответствует определнному таксономическому рангу -70-100 гомологии ДНК свидетельствует о принадлежности к одному виду, -40-60 - к одному роду, -25 - к одному семейству, ближе к 0 - к разным семействам. Однако применяемая в исследованиях по определению гомологии ДНК изотопная метка затрудняла широкое практическое использование подобных методов для индикации и идентификации бактерий. Имеются многочисленные данные об использовании различных модификаций метода гибридизации нуклеиновых кислот без применения радиоактивных изотопов (Мальков И.Г., Артюшин С.К., Фомин Б.А., Коромыслов Г.Ф. Разработка метода идентификации микобактерий человеческого и бычьего видов с использованием ПЦР.// Молек. генетика микроб, вирусол, 1993. -2.- С. 3-9. М.Медицина,. .,Н., ,, //1. //, 1998, . 66, 7, .33033310.). Однако неизотопно меченые тотальные ДНК микроорганизмов не применялись в качестве реперов для определения уровня гомологии нуклеотидных последовательностей. Для использования данного направления при идентификации бактерий необходимо усовершенствовать многие этапы определения уровня гомологии, в том числе выделение ДНК,включение метки в ДНК, постановку реакции гибридизации и регистрацию конечного результата с количественной оценкой гибридных молекул. За последние 20 лет появились также сведения об использовании ДНК - зондов для индикации микроорганизмов и вирусов в различных объектах исследования (Белоусова Р.В., Гончарова Т.М.,Асеев Н.В. и др. Разработка способов и технических средств полевой индикации возбудителей инфекционных заболеваний животных на основе генных зондов. В кн. Вопросы ветеринарной биологии. М, 1994, с. 68-70 Светличкин В.В.,Лысенко А.М., Петров Н.Б. и др. Сравнение различных способов введения метки в ДНК микроорганизмов. Биологические науки, 1985,6, с. 130-135.). В геноме микроорганизмов содержатся уникальные специфичные нуклеотидные последовательности, которые могут использоваться в качестве генных зондов для идентификации микроорганизмов до уровня видового таксона, а также для дифференциации патогенных форм. Это позволяет выявлять микроорганизмы которые трудно обнаружить с помощью культивирования при конкурентном росте на различных питательных средах. Известно, что факторы патогенности могут передаваться от одних штаммов бактерий в другие путем горизонтального переноса генов. Исходя из этого оценка мяса и других объектов ветеринарносанитарной экспертизы должна базироваться не только на групповой или видовой идентификации,но и дифференциации патогенных форм микроорганизмов. Согласно нормативным документам (ГОСТ 21237-75, СанПиН 2.3.2.56096) при сертификации мяса необходимо, в частности, выявление возбудителей болезней животных. Из литературных источников известно, что ДНК-зонды и ПЦР можно использовать для выявления указанных бактерий в различных объектах исследований(Светличкин В.В., Лысенко А.М., Петров Н.Б. и др. Сравнение различных способов введения метки в ДНК микроорганизмов. Биологические науки,1985, 6, с. 130-135.,.,.// . . . . , 1999, . 96,23, . 13288-13293 Квятковская А.Ю. Разработка автоматизированных методов ДНК - диагностики эшерихий и сальмонелл в объектах ветеринарносанитарного надзора.// Автореферат диссертации на соискание учной степени кандидата биологических наук. М, 1998). Для решения этой задачи применялись некоторые модификации методов ДНК-гибридизации и ПЦР с ДНК-зондами и праймерами определенных локусов ДНК. Однако применение методов ДНК-диагностики при ветеринарно-санитарной экспертизе и сертификационных испытаниях для конкретных объектов исследования, в частности мяса и мясопродуктов остатся достаточно актуальной проблемой, так как многие способы индикации и идентификации микроорганизмов далеки от совершенства. Целью изобретения является разработка более совершенных способов ДНК-диагностики лептоспир,контаминирующих мясо и мясопродукты,при помощи синтетических олигонуклеотидных праймеров. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Получение синтетических олигонуклеотидных праймеров Поиск новых синтетических олигонуклеотидных праймеров осуществляют на основе участка гена,общий для всех генов лептоспир -РМ 70, представленного в базе данных),при помощи пакета программного обеспечения. Полученные последовательности нескольких пар праймеров дополнительно тестируют на специфичность с помощью моделирования ПЦР в программес последовательностями геномов,представленных в базе данных . Окончательный выбор праймеров основывают на следующих критериях высокий индекс сходства фрагмента и ДНК различных штаммов, высокая температура отжига (метод), большая длина консенсусов, отсутствие гетеродуплексов. Химический синтез праймеров осуществляют амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе-102. Концентрацию синтетических олигонуклеотидных праймеров в маточном растворе определяют спектрометрическим методом. Нами были выбраны синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные высококонсервативной области генома, участка гена 32, отвечающего за синтез мембранного протеина- 5 3- 5 АССАТСАТСАТСА 3 Пример 2. Способ выявления патогенных вариантов бактериис помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР)- Амплификация участка ДНКкодирующего участок гена 32. Для исследования отбирают пробы внутренних органов и мышц (кусочки размером 1,51,5 см почки, сердца с кровью, селезенки, печени и мышц). Для постановки реакции из полученных пробсуспензии внутренних органов и мышц в количестве 10 мкл вносят непосредственно в ПЦР-смесь, минуя стадию выделения ДНК. Полимеразная цепная реакция. Состав реакционной смеси ПЦР-буфер (608.5, 1,5 мМ 2, 25 М С, 10 мМ 2 меркаптэтанола, 0,1 Тритон Х-100), 0,2 мМ ,по 0,2 мкг каждого праймера, 1.25 е.а. -ДНКполимеразы, 5 мкл взвеси бактерий. Температурный режим проведения ПЦР 94 С 3 мин - 1 цикл 94 С - 60 с, 60 С - 90 с, 72 С - 20 мин- 30 циклов 72 С-10 мин. Определение размера продуктов диагностической ПЦР Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в 2-ном агарозном геле в стандартном трис-боратном буфере ( 8,0) по стандартной методике. Результаты электрофореза учитывают,просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе Трансиллюминатор. Используют маркер молекулярного веса 100 р. Результат ПЦР считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 534 нуклеотидную пару. Таким образом, предлагаемый способ позволяет эффективно выявлять патогенные штаммы видав пробах мясо и внутренних органов (Таблица 1,2). Таблица 1 Приемущества разработанного метода перед стандартными методиками определения лептоспир в исследуемом материале Зернисто-жировая дистрофия с множественными кровоизлияниями Интерстициальный нефрит и острый гломерулонефрит Острый паренхиматозный нефрит Другие поражения Эффективность используемых методов Эффективность используемых методов Количество Выделено Положительсеропозитивных положительных культур ные животных в проб при лептоспир результаты в РМАЛ микроскопическом ПЦР исследовании Преимущества разработанного метода перед стандартной методикой Показатели Длительность (дни) Время исследования одной пробы биоматериала Себестоимость исследования одной пробы (тенге) Трудозатраты (чел.) Необходимость получения чистой культуры Необходимость постановки биологической пробы на лабораторных животных Таким образом, предлагаемый нами способ позволяет проводить эффективное выявление патогенных штаммов видабез стадии культивирования, а также сократить сроки проведения исследований до двух суток, снизить себестоимость диагностики в 3,5 раза, трудозатраты в 2 раза, исключить необходимость выделения чистой культуры и проведения постановки биологической пробы белых мышах. Метод ПЦР по заявленному способу 2 суток 2 суток 500 тенге 1 Способ ускоренной ПЦР-диагностики для определения патогенных штаммов лептоспир в продуктах животноводства, включающий получение и подготовку исследуемого материала и проведение ПЦР с олигонуклеотидными праймерами,отличающийся тем,что ПЦР проводят непосредственно с пробой-суспензией органов животного,используют олигонуклеотидные праймеры -5 С 3, 53, ПЦР проводят в 1 раунд,при получении фрагмента,соответствующего размеру 474 п.н., диагностируют патогенных штаммов.