Способ получения антигена вируса чумы плотоядных

(51) 61 35/14 (2006.01) 61 39/135 (2006.01) 61 37/02 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ чумы плотоядных к перевиваемой линии культуре клеток , замораживание и оттаивание, очистка от балластных белков, концентрирование и инактивирование, центрифугирование и получение надосадочной жидкости, используют штамм вируса чумы плотоядных -0031 КазНИВИ Доберман 2004, который адаптируют к перевиваемой линии клеток , в период проявления цитопических действий на 80-90 монослоя, сосуды с клетками дважды замораживают при температуре - 40 С в течение 24 ч и оттаивают при температуре 8 С,затем вирусную суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы, после чего вирус инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 0,1 в течение 48 часов при температуре 37 С, после окончания времени инактивации суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и добавляют защитную среду, включающую 3 пептона, 2 сахарозы и 1 желатина в соотношении 110 соответственно, затем тщательно перемешивают, разливают в стерильные ампулы или флаконы по 1 мл, подвергают сублимационной сушке и получают целевой продукт.(72) Абишов Абдикалык Абдижаппарович Хайруллаева Куралай Амангельдиевна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ(57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способу получения диагностических препаратов и может найти применение в ветеринарной практике для диагностики чумы плотоядных и выявления антител в сыворотки крови вакцинированных, переболевших или подозреваемых в переболевании плотоядных животных чумой. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении высокоактивного антигена со стабильными свойствами для применения его в серологических реакциях при диагностике чумы плотоядных. Способ получения антигена возбудителя вируса чумы плотоядных, включающий адаптацию вируса Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способу получения диагностических препаратов и может найти применение в ветеринарной практике для диагностики чумы плотоядных и выявления антител в сыворотки крови вакцинированных, переболевших или подозреваемых в переболевании плотоядных животных чумой. Известен способ получения антигена возбудителя вируса чумы плотоядных, включающий адаптацию вируса чумы плотоядных к перевиваемой линии культуре клеток , замораживание и оттаивание, очистка от балластных белков,концентрирование и инактивирование,центрифугирование и получение надосадочной жидкости Патент Российской Федерации.2118823, кл. 01 33/53, 1998. Однако антиген, получаемый по известному способу не обладает достаточной активностью при выявлении антител в сыворотке крови вакцинированных,переболевших или подозреваемых в переболевании плотоядных животных чумой. Задачей изобретения является разработка способа получения стабильного антигена позволяющего выявлять антител против вируса чумы и обладающего достаточной активностью и специфичностью. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении высокоактивного антигена со стабильными свойствами для применения его в серологических реакциях при диагностике чумы плотоядных. Способ получения антигена возбудителя вируса чумы плотоядных, включающий адаптацию вируса чумы плотоядных к перевиваемой линии культуре клеток , замораживание и оттаивание, очистка от балластных белков, концентрирование и инактивирование, центрифугирование и получение надосадочной жидкости, используют штамм вируса чумы плотоядных -0031 КазНИВИ Доберман 2004, который адаптируют к перевиваемой линии клеток , в период проявления цитопических действий на 80-90 монослоя, затем сосуды с клетками дважды замораживают при температуре 40 С в течение 24 ч и оттаивают при температуре 8 С,после чего вирусную суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин,надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы,затем вирус инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 0,1 в течение 48 часов при температуре 37 С, после окончания времени инактивации суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин,надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и добавляют защитную среду,включающую 3 пептона, 2 сахарозы и 1 желатина в соотношении 110 соответственно, затем тщательно перемешивают, разливают в стерильные ампулы по 1,0 мл, подвергают сублимационной сушке и получают целевой продукт. Изобретение осуществляется следующим образом. Для получения антигена используют 2 штамм -0031 КазНИВИ Доберман-2004 вируса чумы плотоядных (Лаборатория по изучению генофонда микроорганизмов, ТОО Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт). Селекция штамма. Штамм вируса чумы плотоядных -0031 КазНИВИ Доберман-2004 проводят методом последовательных 5 пассажей на перевиваемой линии культур клеток , полевого изолята вируса чумы выделенных от больного чумой щенка собак. В качестве исходного материала для адаптации к культуре клеток используют штамм вируса чумы, в виде органо-тканевой суспензии. Адаптацию возбудителя проводят следующим образом. Печень больного чумой щенка в боксе взвешивают и растирают стерильно в фарфоровой ступке с битым нейтральным стеклом до получения однородной массы,разводят 110 фосфатно-буферным раствором рН-7,4. К суспензию добавляют антибиотики (пенициллин и стрептомицин по 200 ЕД на 1 мл биомассы) и экстрагируют при температуре 20 С в течении часа. Полученную 10 суспензию замораживают при температуре минус 40 С в течение 24 ч, оттаивают при температуре 20 С. Затем вирусную суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 минут. Надосадочную вируссодержащую суспензию используют для адаптации к культуре клеток. Адаптацию проводят следующим образом. На каждый пассаж используют по 5 матрасов с культурой клеток, со сплошным плотным монослоем при двух контрольных. Для этого монослой клеток промывают раствором Хенкса 3 раза, после чего вносят вирусный материал в объеме 50 см 3 и ставят на контакт возбудителя с культурой клеток на 1 час, периодически перемешивая через каждые 15 минут. После истечения срока контакта содержимое сосудов сливают и вносят поддерживающую питательную среду с 10-ой сывороткой крови крупного рогатого скота. Инфицированные клетки инкубируют при температуре 37 С. За зараженными клетками наблюдают до появления характерных цитопатических изменений вируса и при охвате 8090 монослоя матрасы замораживают при температуре минус 40 С и размораживают при 8 С. В дальнейшем данную биологическую массу используют для проведения второго пассажа и т.д. После каждого пассажа возбудителя проверяют его биологическую активность путем титрования на пробирочной культуре клеток . Критерием адаптации вируса чумы к культуре клеток служат стабильное проявление цитопатических действий вируса через 36 часов после инфицирования и биологической активностью не менее 5,5 ТЦД 50/см 3. Штамм характеризуется следующими признаками. Морфологические свойства. Вирус чумы плотоядных относится к семействуродус липопротеидной оболочкой диаметром от 150-300 нм. Нуклеокапсид в виде единого тяжа длиной 1 мкм состоит из РНК и белковых субъединиц, уложенных в спираль, мол. масса 6104 Д. Вирионы содержат около 1 одноцепочечной РНК с мол. массой 4-8106 Д, состав оснований А-20-26 Г-24-25 Ц-24-27 У-2231.Вирус чумы плотоядных содержат 6 основных белков -, Н, Р, ,1 и 2 имеющих мол. массу 200000, 76000, 66000, 58000, 40000 и 23000 Д соответственно. Штамм -0031 КазНИВИ Доберман-2004 вируса чумы плотоядных обладает морфологическими признаками, свойственными для возбудителя чумы плотоядных родасемейства . Культуральные свойства. Штамм -0031 КазНИВИ Доберман- 2004 вируса чумы плотоядных репродуцируется и накапливается в перевиваемой культуре клетокв титре 105,5 ТЦД 50/см 3 (титр цитопатических доз, вызывающий 50 цитопатическое действие в монослое клеток). В указанной культуре клеток штамм -0031 КазНИВИ Доберман- 2004 размножается после двукратного перемежающего пассажа по схеме Культура клеток-организм щенка. Выраженное цитопатическое действие вируса установлено на третьем пассаже и время репродукции в культуре клеток 8-10 суток. Антигенные свойства. Штамм-0031 КазНИВИ Доберман-2004 вируса чумы плотоядных репродуцированный в культуре клеток,инактивированный формальдегидом и адсорбированный гидроокисью алюминия при подкожном или внутримышечном введении щенкам собак в дозе 1,0 мл способствует образованию напряженного иммунитета. При контрольном заражении все иммунизированные животные оставались клинически здоровы в течении 10 суток. Патогенные свойства. Штамм-0031 КазНИВИ Доберман-2004 вируса чумы плотоядных у инфицированных интактных щенков вызывает развитие клинических признаков чумы на 4-5 сутки после введения (угнетение, анарексия,повышение температуры,рвота,воспаление слизистых оболочек, диарея, пустулезный сыпь на коже), заканчивающаяся гибелью животных на 3-4 сутки после проявления симптомов инфекции. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма -0031 КазНИВИ Доберман-2004 вируса чумы плотоядных, при пассировании в культуре клетоксохраняются в течение 10 пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Штамм -0031 КазНИВИ Доберман-2004 вируса чумы плотоядных в виде культуральной суспензии не снижает биологической активности в течение 40 сут при температуре 41 С,18 мес - при минус 30 С, а в 20-го органотканевом суспензии 36 мес при минус 40 С. Пример 1. Для приготовления специфического антигена вируса штамм -0031 КазНИВИ Доберман-2004 вируса чумы плотоядных репродуцируют в перевиваемой линии клеток ,выращенный стационарным или роллерным способами в среде ИГЛА-, содержащий 10 сыворотки крови крупного рогатого скота. Для инфицирования используют культур клеток двухсуточного возраста со сплошным монослоем, без каких либо дегенеративных изменений. На 5-6 сутки после заражении клеток, при поражении 60-70 площади монослоя, проводят замораживание сосудов. Через 24 часа после заморозки сосуды размораживают при комнатной температуре, после чего вируссодержащую суспензию объединяют и определяют биологическую активность вируса путем титрования на культуре клеток . Биологическая активность вирусной суспензии,используемый для изготовления антигена должна быть не менее 105,5 ТЦД 50/см 3 Очистку вирусной суспензии от клеточных детритов проводят с помощью хлороформа в конечной концентрации 5 в течении 30 минут при температуре 20 С , после чего центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 минут. Центрифугат сливают в стерильные флаконы и инактивируют раствором формальдегида в конечной концентрации 0,2 в течении 48 ч при 37 С. Остаточный формальдегид в вирусной суспензии нейтрализует 10-ным раствором тиосульфата натрия. После нейтрализации остаточного формальдегида полноту инактивации возбудителя проверяют путем трехкратного пассирования на перевиваемой линии клеток . При пассировании вируса на указанной культуре клеток не должна наблюдаться характерные цитопатические действия вируса. Полученная таким образом вирусная суспензия используется в качестве антигена для постановки серологических реакций при чуме плотоядных. Пример 2. Определение серологической активности и специфичности антигена в РСК и ИФА. Активность и специфичность полученного антигена описанным способом был проверен в лабораторных условиях в РСК и ИФА с положительными и отрицательными сыворотками. Результаты оценки активности и специфичности предлагаемого антигена для серологических реакций при чуме плотоядных приведены в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что антиген вируса чумы плотоядных полученный описанным способом, с серопозитивной сывороткой в разведениях 18, 116 и 164 дает положительные результаты при разведении антигена 132, а с серонегативными сыворотками дает отрицательные результаты, что доказывает его достаточно высокую активность и специфичность. Это позволяет использовать его в качестве антигена для серологических реакций при чуме плотоядных. В готовый антиген добавляют стабилизаторы,содержащей 3 пептона, 2 сахарозы и 1 желатина в соотношении 110 соответственны,тщательно перемешивают, расфасовывают в стерильные ампулы или флаконы по 1 мл,подвергают сублимационной сушке и помешают в холодильник при 4-8 С. Лиофилизацию антигенного материала начинают при - 45 С. Величину вакуума в камере сублимационного аппарата устанавливают в пределах 4,5-7,5 Па. Конечная температура полок аппарата в процессе высушивания 30-35 С. Высушивание при подогреве полок до указанной температуры осуществляют до того момента, когда температура материала достигает 10-12 С, после чего обогрев переводят на температуре 25-30 С. Высушивание при температуре материала 23-25 С проводят в течение 3-4 часов. Ампулы с высушенным антигеном запаивают на карусельно коллекторном аппарате при остаточном давлении 20-25 Па или флаконы с антигеном наполняют инертными газами. Полученный антиген представляет собой пористую гомогенную массу желтовато-белого цвета без посторонних примеси. Антиген может хранятся в лизофилизированном виде 18 месяцев , не теряя своего исходного титра. Таким образом, изготовление антигена для серологических реакций при чуме плотоядных обеспечивает (по сравнению с известным антигеном) высокую активность и специфичность,что позволяет повысить достоверность серологических реакции при диагностике болезни чумы плотоядных. Таблица 1 Оценка активности и специфичности предлагаемого антигена чумы плотоядных штамма -0031 КазНИВИ Доберман-2004 в РСК Разведение сывороток Положительной 14 18 116 Отрицательной 14 18 Контроль Антиген без сыворотки Сыворотка без антигена ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена возбудителя вируса чумы плотоядных, включающий адаптацию вируса чумы плотоядных к перевиваемой линии культуре клеток , замораживание и оттаивание, очистка от балластных белков, концентрирование и инактивирование, центрифугирование и получение надосадочной жидкости, отличающийся тем, что используют штамм вируса чумы плотоядных 0031 КазНИВИ Доберман-2004,который адаптируют к перевиваемой линии клеток , в период проявления цитопических действий на 8090 монослоя, затем сосуды с клетками дважды замораживают при температуре - 40 в течение 24 часов и оттаивают при температуре 8 С, после чего вирусную суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы, затем вирус инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 0,1 в течение 48 часов при температуре 37 С, после окончания времени инактивации суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и добавляют защитную среду, включающую 3 пептона, 2 сахарозы и 1 желатина в соотношении 110 соответственно, затем тщательно перемешивают,разливают в стерильные ампулы по 1,0 мл,подвергают сублимационной сушке и получают целевой продукт.