Способ определения диоксинов в кормах на основе биолюминесцентного анализа

МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ добавках и продуктах животного происхождения, а также для экологического мониторинга окружающей среды. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в разработке экспрессспособа определения диоксинов, основанный на бактериальной биолюминесценции. Способ определения диоксинов в кормах на основе биолюминесцентного анализа, включающий подготовку культуры люминесцентной бактерии,приготовление растворов,измерение люминесценции с тестируемым образцом и расчет индекса токсичности, в качестве тест-системы используют культуру люминесцентных бактерийВ-0273.(72) Сарбаканова Шолпан Таупиковна Латыпова Залина Акрамовна Аубекерова Лаура Сатаевна Касымова Камила Турлыбековна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИОКСИНОВ В КОРМАХ НА ОСНОВЕ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА(57) Изобретение относится к экологобиологической области и может быть использовано при определении диоксинов в кормах, кормовых Изобретение относится к эколого-биологической области и может быть использовано при определении диоксинов в кормах, кормовых добавках и продуктах животного происхождения, а также для экологического мониторинга окружающей среды. Известен способ определения токсичности объектов окружающей среды, в котором используют штамм бактериив качестве тесткультуры,включающий подготовку люминесцентных бактерий,приготовление растворов,измерение люминесценции с тестируемым образцом, расчет индекса токсичности Патент Российской Федерации 2346035, кл. С 12 1/20, 2008. Недостатком указанного способа является то, что данный способ не используется для биотестирования диоксинов и суперэкотоксикантов. Задачей изобретения является разработка метода определения диоксинов в кормах, кормовых добавках и в продукции животного происхождения на основе биолюминесцентного анализа. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в разработке экспрессспособа определения диоксинов, основанный на бактериальной биолюминесценции. Способ определения диоксинов в кормах на основе биолюминесцентного анализа, включающий подготовку культуры люминесцентной бактерии,приготовление растворов,измерение люминесценции с тестируемым образцом и расчет индекса токсичности, в качестве тест-системы используют культуру люминесцентной бактерииВ-0273. Штамм бактерииВ-0273 депонирован в ТОО Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(КазНИВИ). Идентификацию штамма бактерии проводят по основным культурально-морфологическим,биохимическим и антигенным свойствам, согласно определителю Берджи (М. 2005), том 1., род, с. 198. Штамм бактерииВ 0273. Селекция штамма. Штамм бактерииВ-0273 выделен из рыбы в Индийском океане. Штамм получен путем ступенчатого отбора. Морфологические признаки.В-0273 толстые прямые палочки, 0,81,31,8-2,4 мкм,грамотрицательные,не размножаются почкованием, подвижные за счет 1-3 полярных, неочехленных жгутиков, не образуют простеки, стебельки. Культуральные свойства. Хемоорганотрофы,факультативные анаэробы,обладающие и дыхательным и бродильным типами метаболизма. Условия культивирования РПА (питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМагар), натрия хлорид (химически чистый), агарагар) ПРПА(питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ 2 агар). Через 16 часов наблюдается насыщенное свечение продолжительностью 72 часа. Условия роста на РПА, 18-20 С, 72 часа ПРПА, 1820 С, 72 часа. Колонии на плотной среде гладкие, формы, белого цвета, нежные, зеленоватоголубоватые, светятся в темноте. В жидкой среде ПРПА, растут при 4 С, большинство прекращают рост при 25 С, оптимум роста при 18-20 С, 72 часа. Оптимальная среда 7.0-7.2. Характер роста на жидкой среде - равномерное помутнение среды,светятся в темноте при встряхивании. В полужидком агаре имеет компактную форму роста. Биохимические свойства. В-0273 каталазаположительные и оксидазоотрицательные. Не гидрализует крахмал и желатин. Характерный продукт брожения - газ. Не образует сероводород и индол. В результате восстановительных реакций флавинмононуклеотида,кислорода,длиноцепочеченого альдегида в присутствии фермента люциферазы образуют жирную кислоту,воду и видимый свет. Иммунохимические свойства. Иммунохимическими свойствами не обладает. Патогенные свойства. Не патогенен. Консервация и хранение. Консервацию и хранение штаммаВ-0273 на питательной среде осуществляют при помощи рыбо-пептонного агара, при 18-20 С. Сроки пересева 1 раз в 3 дня. Хранение под минеральным маслом осуществляют на полужидком агаре под вазелиновым маслом, при -4 С. Сроки пересева 1 раз в 2 месяца. Изобретение осуществляется следующим образом Пример 1. Для определения зависимости интенсивности люминесценции от количества бактерий в фотометрическую кювету добавляют 4,0 см 3 3-го раствора хлорида натрия, измеряют показатель биолюминесценции для получения базовой линии в качестве нулевого показателя. Готовят тест-систему из суточной культурыВ-0273. В пробирку с суточной культурой добавляют 3 см 3 3 раствора натрия хлорида, тщательно ресуспендируют для максимального намыва (выхода) бактерий. Далее микропипеткой добавляют строго определенное количество (шаг по 20 мкл) биолюминесцентных бактерий из заранее приготовленного концентрата(3 млрд клеток в см 3). Максимальный показатель прибора по интенсивности (1000) принимают за 100. Максимальный уровень люминесценции наблюдается при использовании бактерий в объеме 260 мкл суспензии, что соответствует концентрации 108 клеток в кювете люминометра (объем кюветы 4,0 см 3). Пример 2. Для проведения анализа используют биолюминесцентную систему клеточную суспензию культуры бактерииВ-0273. Концентрация бактерий доводится до 3-4 млрд клеток в см 3 по эталонному бактериальному стандарту мутности. Далее определяют влияние диоксина на люминесценцию бактерии В-0273. С этой целью в кювету с суспензией бактерииВ-0273,концентрация которой составляет 108 клеток, добавляют 10 мкл раствора диоксина с концентрацией 10-11 г/л или диоксин содержащий образец выделенный из кормов для животных. Затем измеряют люминесценцию. При добавлении диоксина наблюдается резкое падение интенсивности свечения,которое достигает минимума в течение 5-8 минут. Используя полученные данные, рассчитывают индекс токсичности диоксина по формуле ИТ(-)/100, где ИТ - индекс токсичности- интенсивность свечения в анализируемой пробе- интенсивность свечения в контрольной пробе. В последующем эксперименте в фотометрическую кювету с кулбьурой люминесцентной бактерии добавляют 0,2 мл раствора диоксина с концентрацией 10 нг/л с получением итоговой концентрации диоксина 0,5 нг/л. В течение первых 2 мин биолюминесценция снижается на 99, что означает почти полное подавление люминесценции бактерии. Наибольшая токсичность диоксина проявляется в концентрации 0,5-10-9 г/л,подавление люминесценции бактерии за 2 минуты - 98,63, в концентрации 2,5-10-15 г/л - 85, и даже следы диоксина снижают люминесценцию на 10. Заявляемый способ определения диоксинов в кормах на основе биолюминесцентного анализа является одним из самых чувствительных,отличается высокой информативностью, может обнаружить следы диоксинов, при этом время проведения анализа составляет в среднем 30 минут. Использование разработаного способа определения диоксинов в кормах на основе биолюминесцентного анализа позволит существенно упростить процедуру анализа,сократить время и затраты при тестировании кормов на содержание диоксинов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ определения диоксинов в кормах на основе биолюминесцентного анализа, включающий подготовку культуры люминесцентной бактерии,приготовление растворов,измерение люминесценции с тестируемым образцом и расчет индекса токсичности, отличающийся тем, что в качестве тест-системы используют культуру люминесцентной бактерии