Способ получения аттенуированных штаммов бактерии PАSTEURELLA MULTOCIDA для приготовления профилактических и диагностических препаратов

(51) 12 1/20 (2006.01) 61 39/102 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ индуцируется под воздействием физического мутагена УФ - облучение вызывает замену оснований и образование делеций, что очень важно для получения стабильных мутаций, последующие опыты были направлены на повышение резистентности к стрептомицину 20000 мкг/мл,которые должны привести к снижению патогенности мутанта, стабилизация признака резистентности к стрептомицину 20000 мкг/мл достигалась посредством воздействия на него третьего химического независимого мутагенного фактора - 2-аминопурина. Каждая мутация обуславливает значительное снижение вирулентности. В то же время наличие нескольких независимых мутаций создает невозможность реверсий аттенуированных штаммов к исходному состоянию вирулентности и снижением патогенности на 7-8 порядков с диким типом пастерелл. С помощью вышеописанного способа получен аттенуированный штамм бактерий///20000,депонированный в лаборатории Коллекции микроорганизмов Республиканское государственное предприятие Научно исследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан,используемый для получения диагностических и профилактических препаратов.(72) Жилин Евгений Сергеевич Еспембетов Болат Аманбаевич Зинина Надежда Николаевна Безрукова Анастасия Николаевна Кайсенов Дастан Назбекович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АТТЕНУИРОВАННЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИИ АДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности к ветеринарной микробиологии и иммунологии, и может быть использовано для получения живых аттенуированных вакцин, а также диагностических препаратов из патогенных штаммов. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении более безопасных аттенуированных штаммов, с помощью трех стадий независимых мутаций первая из которых возникает спонтанно и придает клеткам устойчивость до 1000 мкг/мл стрептомицина, вторая Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к ветеринарной микробиологии и иммунологии, и может быть использовано для получения живых аттенуированных вакцин, а также диагностических препаратов из патогенных штаммов. Пастереллез - высококонтагиозное заболевание многих видов сельскохозяйственных животных, с высокой летальностью, вызываемый бактериями вида. Пастереллез представляет серьезную проблему в животноводстве, поскольку возбудитель -обладает способностью мигрировать к разным видам животных, приживляться в их организме и вызывать заболевания опасные для них. Наиболее эффективным средством профилактики инфекции, вызванной, являются аттенуированные вакцины, приготовленные на основе ослабленных или авирулентных штаммов возбудителя, полученные различными путями. В том числе индуцированного мутагенеза и дальнейшего отбора мутантных производных возбудителя,устойчивых к антибиотикам. Антибиотикоустойчивые генетические маркеры позволяют дифференцировать вакцинные штаммы от полевых. Известен способ получения стрептомицинзависимого штамма,обладающего иммуногенными свойствами,путем отбора устойчивых к стрептомицину мутантов (. .- 1989, 39,3 .229-233). Однако используемый подход не привел к получению эффективной вакцины, так как существует вероятность возникновения возврата к дикому типу штамма. В российской патентной заявке 2103355(Степаншин Ю.Г. Манзенюк И.Н. Светоч Э.А. Гусев В.В.) описан способ получения аттенуированных иммуногенных штаммовпутем посева бактериальной взвеси на питательную среду, содержащую стрептомицин, с последующим инкубированием и отбором стрептомицинустойчивых мутантов с устойчивостью к 10000 мкг/мл стрептомицина, с помощью двух независимых мутаций Недостатком этого способа является вероятность возникновения реверсий т.е. мутаций, приводящих к возврату к дикому типу штамма. Задачей изобретения является разработка живых достаточно аттенуированных штаммовс резистентностью к стрептомицину 20000 мкг/мл,которые должны вызывать иммунность у животных, инокулированных данным организмом и обеспечивать защиту от последующего введения вещества вирулентным штаммом. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении более безопасных аттенуированных штаммов, с помощью трех стадий независимых мутаций первая из которых с учетом литературных данных возникает спонтанно и придает клеткам устойчивость до 1000 мкг/мл стрептомицина, вторая индуцируется 2 под воздействием физического мутагена УФ облучение вызывает замену оснований и образование делеций, что очень важно для получения стабильных мутаций, последующие опыты были направлены на повышение резистентности к стрептомицину 20000 мкг/мл,которые должны привести к снижению патогенности мутанта, стабилизация признака резистентности к стрептомицину 20000 мкг/мл достигалась посредством воздействия на него третьего химического независимого мутагенного фактора - 2-аминопурина. Каждая мутация обуславливает значительное снижение вирулентности. В то же время наличие нескольких независимых мутаций создает невозможность реверсий аттенуированных штаммов к исходному состоянию вирулентности и снижением патогенности на 7-8 порядков с диким типом пастерелл. Пример. Суточную культуру штамма//2011//, выделенного из патологического материала от сайгаков в Западном Казахстане в 2011 г высевали на питательный агар(далее )с содержанием в нем 1, 5, 10, 50, 100, 1000 мкг/мл стрептомицина. Инкубировали чашки со средойсо стрептомицином при температуре 37 С в течение 24-48 ч. По истечении времени инкубации культуру оценивали визуально по образованию колоний. Повышение резистентности к антибиотику достигалось посредствам пассирования, полученных клонов на твердых и жидких питательных средах( и ) с постепенным увеличением концентрации стрептомицина в среде. Таким образом, в результате проведенных опытов получен мутантрезистентный к стрептомицину в дозе 900 мкг/мл (.900). При получении стрептомицин зависимых клоноврезистентных к повышенному содержанию стрептомицина в питательных средах,полученные спонтанные мутанты подвергали физическому и химическому мутагенезу. Для этой цели использовали 18 ч. бульонс мутантом резистентным к стрептомицину 900 мкг/мл. Культуру облучали ультрафиолетом с длиной волны 253,7 нм в экспозиции 40 сек. и после чего облученные клетки высевали надля определения жизнеспособных клеток и инкубировали в течение ночи при температуре 37 С. Данные опыты были проведены в полной темноте во избежание фотореактивации, чтобы получить ряд независимых мутантов. Процент гибели клеток определяли по разнице роста колоний наподвергнутых воздействия ультрафиолета и контрольных средах без обработки УФ. Последующие опыты были направлены на повышение резистентности к стрептомицину,которая должна привести к снижению патогенности мутанта. С этой целью проведены опыты по его последовательному пассированию на питательных средах с постепенным увеличением концентрации стрептомицина в среде (900-20000 мкг/мл). В результате экспериментов получен мутант с резистентностью к стрептомицину 20000 мкг/мл. Стабилизация признака резистентности к стрептомицину полученного штаммадостигалась посредством воздействия на него третьего независимого мутагенного фактора 2-аминопурина. Для этой цели мутант инкубировали в течение ночи на- бульоне содержащим 20000 мкг/мл стрептомицина. Затем полученную культуру разводили свежим бульоном содержащим 500 мкг/мл 2-аминопурина, и инкубировали далее при 37 С на качалке до интенсивного помутнения среды. Изучение эффекта стрептомицин зависимости штаммаповодили посредством высева бактериальных культур мутантов на средусибез антибиотика. Показатель уровня (ЛД 50) патогенности для штамма составил 9,50,7107 мк, что соответствовало повышению уровня аттеннуации на 2-3 порядка по сравнению с мутантом резистентным к стрептомицину 10000 мкг/мл и на 7-8 порядков с исходным вариантом пастерелл. Для оценки характера наследования и стабильности приобретенных признаков штамма, культура была пропассирована на средебез антибиотика (до 10 пассажей), с последующими рассевами 50 субклонов каждого клона на(20000 мкг/мл ). Ни одна из 150 колоний не утратила устойчивости к стрептомицину,что свидетельствовало об отсутствии разделения исследуемых клонов по признакуи стабильности наследования данной мутации после 10 последовательных пересевов без селективного давления антибиотика. Изучение иммуногенности полученного аттенуированного штамма проводят путем подкожного введения 103-107 клеток(иммунизация) белым мышам с последующим заражением через 14 дней исходным штаммом в дозах 10, 25 и 100 50. Согласно полученным данным иммунизация животных в дозах 105-108 обеспечивает защиту 90-100 животных при контрольном заражении исходного вирулентного штамма в дозе 10 50. По результатам анализа, полученным, с помощью выше описанного способа аттенуированный штаммне утрачивает приобретенных свойств, а именно устойчивость к стрептомицину 20 000 мкг/мл. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения аттенуированных штаммов бактерийдля приготовления профилактических и диагностических препаратов,включающий посев бактериальной культуры на питательные среды содержащие стрептомицин в повышающихся концентрациях(от 1 до 20000 мкг/мл среды),с последующим культивированием стрептомицин резистентных мутантов, отличающихся тем, что отбор проводят с помощью трех стадий независимых мутаций отбирают спонтанные мутанты с устойчивостью к 900-1000 мкг/мл стрептомицина, затем пастереллы облучают ультрафиолетом при длине волны 253,7 нм с экспозицией 40 сек, после чего проводят отбор мутантов имеющих резистентность к стрептомицину 20000 мкг/мл, которые подвергают воздействию 2-аминопурина (500 мкг/мл), с последующим отбором мутантов резистентных к стрептомицину 20000 мкг/мл и имеющих максимальную степень аттенуации при подкожном введении мышам.