Штамм вируса оспы овец “К-45″ АV-700, используемый для изготовления живой сухой вакцины против оспы овец

(51) 12 7/00 (2006.01) 61 39/205 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и может быть использовано для специфической профилактики оспы овец. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении штамма вируса оспы овец,способного активно репродуцироваться в первичных и перевиваемых культурах клеток и пригодного для изготовления иммунологически эффективной живой сухой вакцины. Штамм вируса оспы овец К-45 -007 депонирован в лаборатории вирусных препаратов ТОО БиоВет, используемый для изготовления живой сухой вакцины против оспы овец.(72) Кутумбетов Леспек Бекболатович Мырзахметова Балжан Шайзадаевна Тургенбаев Кайрат Алтынбекович Борсынбаева Асия Маденовна(54) ШТАММ ВИРУСА ОСПЫ ОВЕЦ К-45 А-700,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЖИВОЙ СУХОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ОСПЫ ОВЕЦ Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано при изготовлении вакцины против оспы овец. Известен штамм вируса оспы овец,культивируемый в перевиваемой культуре клеток ПО, используемый для изготовления вакцины против оспы овец. Предварительный патент РК 9902791 от 11.03.1999 г Недостатком известного штамма вируса является то, что он является гиператтенуированным из-за культивирования в перевиваемой культуре клеток и не обладает достаточной иммуногенностью при подкожной прививке овец. Задачей изобретения является получение штамма вируса оспы овец, способного репродуцироваться в культуре первичных и перевиваемых клеток в высоких титрах и обладающего повышенной иммуногенностью для овец. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении штамма вируса оспы овец,способного активно репродуцироваться в первичных и перевиваемых культурах клеток и пригодного для изготовления иммунологически эффективной живой сухой вакцины. Штамм вируса оспы овец К-45 -007 депонирован в лаборатории вирусологии ТОО БиоВет, используемый для изготовления живой сухой вакцины против оспы овец. Штамм вируса оспы овец К-45 -007 Штамм получен из вирулентного вируса оспы овец, выделенного из папулезных поражений легкого мертворожденного ягненка от овцематки,больной оспой, доставленной из приусадебного хозяйства Алматинской области,путем последовательного пассирования в культуре клеток ТЯ (тестикул ягненка) и ТЯ- КК 49 (перевиваемая культура клеток, полученная из тестикулярной ткани ягненка). Полученный штамм характеризуется следующими признаками. Назначение штамма штамм вируса оспы овец К-45 -007 аттенуированный, не обладает патогенностью по отношению к овцам и козам при внутрикожной,внутривенной и подкожной инокуляции, активно репродуцируется в культурах клеток ТЯ и ТЯ-КК 49. Штамм вируса обладает высокой иммуногенной эффективностью и используется для изготовления сухой живой вакцины. Штамм вируса К-45 007 получают путем репродукции в культурах клеток ТЯ и ТЯ-КК 49, выращенных в плоских матрасах стационарным и круговых сосудах роллерным способами. Морфологические признаки. Вирионы кирпичеобразной формы, размером в пределах 200300 нм. Культуральные свойства. Штамм вируса оспы овец К-45 -007 репродуцируется в культурах клетках ТЯ и ТЯ-КК 49, накапливается в титрах 106,00-107,0 ТЦД 50/см 3,вызывающие 50 цитопатический эффект в культуре клеток. Штамм вируса оспы овец К-45 -007 репродуцируется в 2 культурах клетах ТЯ и ТЯ-КК 49 без дополнительных адаптационных пассажей и накапливается в максимальных титрах на 5-7 сутки после инфицирования. Антигенные свойства. Штамм вируса оспы овец К-45 -007 в репродуктивном виде в организме иммунизированных овец и коз стимулирует образование вируснейтрализующих,комплементсвязывающих и преципитирующих антител в титрах 2,40,3 2, 41 2, 30,5 2,соответственно. Патогенные свойства Штамм вируса оспы овец К-45 -007 не обладает патогенностью по отношению к восприимчивым животным при внутрикожном,внутривенном,подкожном заражении. Иммуногенные свойства Штамм вируса оспы овец К-45 -007, репродуцированный в культурах клеток ТЯ и ТЯ-КК 49 в дозе от 1000 ТЦД 50/см 3 и более обладает способностью стимулировать напряженный иммунитет против оспы у овец и коз, -привитых подкожным способом. Стабильность свойств при пассировании Основные иммуннобиологические свойства штамма вируса оспы овец К-45 -007 при пассировании в культурах клеток ТЯ и ТЯ-КК 49 сохраняются на протяжении не менее 10 пассажей. Сохраняемость. Штамм вируса оспы овец К-45-007 в виде культуральной суспензий не снижает свою биологическую активность в течение 10 суток при температуре 41 С, 12 мес - при температуре минус 40 С и ниже. Пример 1. Для приготовления сухой живой вакцины против оспы овец в начале готовят первичную монослойную культуру клеток ТЯ(тестикулы ягнят) и в нем продуцируют аттенуированный штамм К-45 вируса оспы овец. Для получения монослойной культуры клеток ТЯ от ягнят-баранчиков 3-5 мясечного возраста асептически собирают тестикулы, которые, после очистки от соединительной ткани и размельчения,подвергают трипсинизации с помощью магнитной мешалки и 0,25 раствора трипсина. Трипсинизированные клетки отделяют от межклеточной соединительной ткани путем фильтрации через четырехслойный марлевый фильтр. Затем клетки осаждают центрифугированием при 1000 в течение 10 мин. Раствор трипсина удаляют, осадок клеток ресуспендируют в питательной среде Игла,содержащей 10 сыворотки крови крупного рогатого скота, до концентрации 25050 тыс. кл./см 3(клеток на один см 3) и высевают полученную суспензию по 150 см 3 в плоские стеклянные матрасы вместимостью 1,5 дм 3. Матрасы с суспензией трипсинизированных клеток помещают в термостат с температурой в камере 370,5 С. За клетками наблюдают ежедневно путем микроскопирования. В сроки образования полного монослоя клеток (монослойной культуры клеток) на внутренней поверхности матраса удаляют питательную среду, проводят заражение клеток штаммом К-45 вируса оспы овец в дозе 0,01 ТЦД 50/кл В матрасы с зараженной культурой клеток вносят свежую питательную среду Игла,содержащую 5 сыворотки крови крупного рогатого скота, и помещают их в термостат при температуре 370,5 С. За культурой клеток наблюдают ежедневно путем микроскопии монослоя,регистрируя появление и развитие ЦПД (цитопатогенное действие) вируса. В период достижения интенсивности развития ЦПД в 70-80 и более площади монослоя культуры клеток культуральную суспензию в матрасах замораживают при температуре минус 40 С и ниже в течение от 12 ч. Затем замороженную культуральную суспензию с вирусом размораживают, из нескольких матрасев собирают в одну емкость, получая общую вируссодержащую культуральную суспензию. Вирусную суспензию подвергают контролю на стерильность по ГОСТ 28085 и биологическую активность по цитопатогенному титру. После получения результатов контроля, в случае стерильности и наличии титра вируса не ниже 105,5 ТЦД 50/см 3, вируссодержащую культуральную массу используют для приготовления вакцины. Для этого вирусную культуральную суспензию в равных объемных соотношениях смешивают со стабилизирующим составом, содержащим 8 пептона, 10 сахарозы и 2 желатина. Добавляют 4 раствор гентамицина в дозе 5 см 3 на 1 дм 3 вирусной суспензии. Полученную смесь тщательно перемешивают и разливают в пенициллиновые флаконы по 1-2-4 см 3. Стабилизированную вирусную суспензию во флаконах замораживают при температуре минус 50 С в течение от 18 ч и подвергают сублимационной сушке с помощью специального аппарата. По завершению сушки флаконы с сухой массой герметизируют специальными пробками и колпачками. Полученный таким образом сухой препарат хранят при температуре 2-8 С и после стандартизации качества используется в качестве вакцины против оспы овец. Вакцину подвергают стандартизации по стерильности согласно требованиям ГОСТ 28085,безвредности и иммуногенности. Для проверки безвредности вакцину в не менее 3 флаконах растворяют стерильным физиологическим раствором хлорида натрия, из содержимых этих флаконов путем смешивания готовят среднюю пробу, которую вводят в дозе 1,0 см 3 внутримышечно 3-м овцам 1-2 летнего возраста не ниже средней упитанности. За овцами наблюдают в течение 10 суток. У всех привитых овец не должны развиваться какие-либо патологии местного и общего характера в течение всего периода наблюдения. Для проверки иммуногенности среднюю пробу вакцины разводят физиологическим-растворм хлорида натрия в соотношении 120 и в дозе по 1,0 см 3 вводят подкожно 4-м овцам в возрасте 1-2 лет не ниже средней упитанности. Столько же овец аналогичного возраста и упитанности оставляют в контроле без прививки вакциной. Через 14 суток всех 4 овец, подвергнутых вакцинации и всех 4 овец, находящихся в контроле подвергают контрольному заражению вирулентным вирусом оспы овец в дозе 5102-103 ИД 50/0,5 см 3. Вирус вводят животным внутрикожно в области подхвостовой складки. За зараженными животными ведут клиническое наблдение в течение 14 суток с регистрацией патологий общего и местного характера. Вакцина считается иммуногенной, если все овцы, подвергнутые вакцинации, в течение всего наблюдаемого периода остаются здоровыми, а овцы контрольной группы заболевают оспой с развитием характерных клинических признаков болезни. Имеющиеся иммунобиологические свойства штамма -007 К-45 вируса оспы овец позволяют производить высокоиммуногенную,безвредную, живую сухую вакцину, применение которой на практике позволит эффективно регулировать эпизоотическую ситуацию по оспе среди овец. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм вируса оспы овец К-45 -700,депонирован в лаборатории вирусных препаратов ТОО БиоВет, используемый для изготовления живой сухой вакцины против оспы овец.