Способ накопления и культивирования Ү-вируса картофеля

(51) 12 7/00 (2006.01) 01 33/531 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ созданию круглогодичного источника вирусоспецифического антигена-вируса картофеля . Технической задачей изобретения является получение растений-регенерантов .длительно сохраняющих вирус картофеля . Способ заключается в инокуляции растений .инфекционным соком пробирочных растений картофеля, зараженных моноинфекцией, индукцией каллусаиз листовых эксплантов, получением растений-регенерантов,которые высаживают в почву и культивируют в камере искусственного климата в течение 10 месяцев, поддерживая круглосуточное освещение на каждом этапе эксперимента. Предлагаемая технология накопления -вируса картофеля позволяет иметь круглогодичный источник вируса картофеля, культивируемогоилив виде растений-регенерантов.(72) Хасанов Вадим Тагирович Бейсембина Бибигуль Фида Мохаммад Ахмади Курманбек Аружан Ержанбековна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(57) Изобретение относится к фитовирусологии, в частности иммунодиагностики вирусов растений, 29150 Изобретение относится к фитовирусологии, в частности иммунодиагностики вирусов растений,созданию круглогодичного источника вирусоспецифического антигена-вируса картофеля . Известен способ накопления -вируса картофеля в тест-растении.. При этом вирус определяется на 15-й день с момента инокуляции. Однако максимальная концентрация вируса в инфицируемом тестрастении наблюдается в течение 15 суток, затем резко падает Гнутова Р.В. Серология и иммунохимия вирусов растений. - М. Наука, 1993,с.21. Для накопления вируса с целью выделения вирусного антигена используют растения табака Самсун , иммунного к ВТМ, которые заражают инфекционным соком,содержащим штамм-0-1 Л, полученным из штаммовых растений табака. Зараженные растения выращивают в изолированных условиях в теплице или пленочномарлевом домике. За ними проводят уход, который заключается в поливе водопроводной водой и рыхлении почвы. Максимальное накопление вируса наблюдается через 14-20 дней после заражения. Перед срезанием листьев все растения проверяют на наличие вируса и отсутствие других вирусов методом иммуноферментного анализа Пат. 12 7/00, 01 33/531. Российская Федерация. Штамм-вируса картофеля для получения антигена,используемого при производстве иммуноферментного диагностикума/ Ю.А. Варицев, Л.И. Егорова, Г.П. Варицева и др. заявитель и патентообладатель Научнопроизводственная фирма Биотехцентр. 2068882, заявл. 22.10.1993 опубл. 10.11.96, Бюл. 31. с.5. Недостатком указанных способов является кратковременное поддержание вируса в растении в высокой концентрации, ограничивающее нарастание биомассы растения, приводящее к значительному уменьшению выхода вирусного антигена. Известен также способ накопления и культивирования вируса,индуцированной из листовых эксплантов растений на агаризованной питательной среде Мурасиге и Скуга, содержащей кинетин - 2 мг/л, 2,4-Д - 0,5 мг/л,ИУК - 1 мг/л, сахарозу - 2 и агар-агар - 0,7. Выделение вирусных антигенов из каллусной ткани позволяет получить в течение 5-6 месяцев Поддержание -вируса картофеля в культуре каллусной тканиДоклады Всесоюзной ордена Ленина и ордена Трудового Красного знамени академии с.-х. наук / А.М. Тимошенко, В.А. Внучкова, В.К. Вишниченко и др.- М. Агропромиздат, 7, 1989. с.8-11. Данный способ является наиболее близким техническим решением (прототипом) предлагаемого изобретения. Недостатком указанного способа является постоянная зависимость от ежемесячных 2 стерильных работ по пассированию (пересадке) каллусной ткани на свежую питательную среду. Кроме того, длительное культивирование (более 5-6 месяцев) каллуса приводит к снижению содержания вируса в ней. Предлагаемое изобретение позволяет устранить указанные недостатки. Технической задачей изобретения является получение растений-регенерантов .длительно сохраняющих вирус картофеля . Способ заключается в инокуляции растений ., которую проводят инфекционным соком пробирочных растений картофеля, оптическая плотность (А 490) иммуноферментного анализа(ИФА) которых составляет не менее 2000 усл. ед. Из листьев инокулированных растений на 20-25-е сутки индуцируют каллус, получая растения-регенеранты со сниженным иммунитетом к . Полученные растения-регенеранты либо размножают,либо после укоренения на среде высаживают в почву и культивируют в камере искусственного климата с интенсивностью освещенности 1000 люкс и температуре 18-20 С,поддерживая круглосуточное освещении на каждом этапе эксперимента. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. На первом этапе растениясорта Самсун в фазе 3-5 листьев инокулируют инфекционным соком пробирочных растений картофеля сорта, оптическая плотность ИФА (А 490) которых составляет не менее 2000 ул. ед. Успешно инфицированные тестрастения, согласно данным сэндвич-варианта ИФА, на 20-25-е сутки используются в качестве доноров для получения каллусных культур. На втором этапе листья растенийсрезают стерилизуют 5 хлорамином и трижды ополаскивают стерильной водой. Далее из стерильных листьев получают экспланты размером не менее 0,5-0,7 мм и культивируют на агаризованной питательной среде Мурасиге и Скуга,включающей кинетин - 2 мг/л, 2,4-Д - 0,5 мг/л,индолилуксусную кислоту - 1 мг/л, сахарозу - 2 и агар-агар - 0,7. Инкубация проводится при постоянном освещении и температуре 25 С. На 2530-е сутки получают первичный каллус. На третьем этапе достаточно развитый первичный или многократно культивируемый на вышеуказанной агаризованной питательной среде морфогенный каллус в чашках Петри начинает образовывать структурированные очаги и меристематические зоны ярко-зеленого цвета. Через 1 неделю отмечают появление апексов, которые при дальнейшем культивировании превращаются в микропобеги. Когда они достигают высотой более 10 мм, их отделяют от каллусной ткани и переносят на жидкую безгормональную среду МС. Через 5-10 дней отмечают появление корней. Накопление вирусного антигена в тест-растениях и их каллусной ткани контролируют с помощью сэндвич-варианта ИФА. На четвертом этапе полученные из каллуса растения-регенеранты высаживают в торфогрунт Живая земля в смеси с дерновой землей в соотношении 11 и культивируют в камере искусственного климата при постоянном освещении и температуре 20-25 С. На 270-300-е сутки выращивания в камере искусственного климата при круглосуточном освещении с интенсивностью 1000 люкс и растения-регенеранты температуре 18-20 С продолжали проявлять симптомы заражения ,что подтвердилось результатами ИФА (таблица 1). Таблица 1 Динамика накопленияв культуре .иРастения, сорт, условия культивирования Растение, ,Оптическая плотность ИФА, усл. ед. на 15-е на 25-е на 30-е на 40-е на 270-е сутки сутки сутки сутки сутки 0,826 1,335 0,767 0,238 0,027 Положительная реакция ИФА натакже установлена у постоянно пассируемых в течение указанного времени каллусных культур. Пример 2. Растения-регенеранты получают тем же способом, что и в примере 1 в аналогичных условиях культивирования. Однако, полученные растения-регенеранты оставляют в пробирочной культуре и периодически 1 раз в 1,5 месяца размножают методом микрочеренкования на жидкой безгормональной питательной среде на минеральной основе по Мурасиге и Скугу,включающей 2 сахарозы, при 5000-10000 лк.,температуре 20-25 С, относительной влажности воздуха 60-70, круглосуточном освещении. По мере необходимости пробирочные растения. могут быть переведеныи доращивают в камере искусственного климата. Следует отметить, что полученные из каллуса растения-регенерантыпроявляют как, так ихарактерные длясимптомы заражения (посветления вдоль жилок,крапчатость) и были способны обнаруживать в ИФА вирусную инфекцию в течение 10 месяцев с момента инокуляции,в отличие от инокулированных растенийс отрицательной реакцией на исследуемый вирус в ИФА и не проявляющих никаких симптомов заражения на данный период культивирования в камере искусственного климата. Необходимо отметить, что кроме симптомов заражения вирусом полученные растениярегенеранты имели остроконечную форму листовой пластики, суженную к основанию черешка в отличие от здоровых растений, имеющих обратнояйцевидную форму. Таким образом,полученные растениярегенеранты доращиваемые в камере искусственного климата пониженного круглосуточного а в почвенном субстрате в условиях освещения и температуры могут быть использованы для получения вирусного антигенав течение весьма длительного периода его культивирования. Изобретение позволяет исключить дополнительные расходы на приобретение химических реактивов и освобождает от работ по ежемесячному пассированию каллусных культур. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ накопления и культивирования -вируса картофеля, включающий инокуляцию растенийинфекционным соком растений картофеля, зараженных моноинфекцией - ,индукцией каллусаиз листовых эксплантов на питательной среде МС с 2 мг/л кинетина, 0,5 мг/л 2,4-Д,1 мг/л ИУК,2 сахарозы и культивированием при температуре 25 С при 16 световом фотопериоде, отличающийся тем, что на первом этапе инокуляцию растений проводят инфекционным соком пробирочных растений картофеля, оптическая плотность ИФА (А 490)которых составляет не менее 2000 усл. ед, на втором этапе из листьев инокулированных растений на 20-25-е сутки индуцируют каллус, получая растения-регенеранты,которые либо размножают, либо после укоренения на среде высаживают в почву и культивируют в камере искусственного климата с интенсивностью освещенности 1000 люкс и температуре 18-20 С, поддерживая круглосуточное освещение.