Способ получения эмбриогенных каллусных тканей пшеницы способных к длительной регенерации растений

(51) 12 5/04 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ сельскохозяйственных растений методом культуры клеток и тканей, и может быть использовано в работах по генной и клеточной инженерии, в исследованиях по генетике и физиологии морфогенеза, в генетике и селекции пшеницы. Способ получения,включающий культивирование в течение месяца глобулярных каллусов пшеницы на модифицированной среде Мурасиге и Скуга (МС), дополненной 2,4 Д (1,0 и 5,0 мг/л), удвоенной концентрацией минеральных солей (макроэлементов) среды МС (стресс),1000 мг/л гидролизатом казеина, 500 мг/л пролином и 30 г мальтозы, последующее субкультивирование(месяц) каллусов на той же среде с однократной концентрацией минеральных солей среды МС, и формирование плотных эмбриогенных каллусов,эмбриогенный и регенерационный потенциал которых сохранялся в течение 10-12 пассажей.(72) Бишимбаева Назира Козыкеевна Амирова Айгуль Кузембаевна Карабаев Мурат Карабаевич Рахимбаев Избасар Рахимбаевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт биологии и биотехнологии растений Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭМБРИОГЕННЫХ КАЛЛУСНЫХ ТКАНЕЙ ПШЕНИЦЫ СПОСОБНЫХ К ДЛИТЕЛЬНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в экспериментах по генной и клеточной инженерии, в исследованиях по физиологии морфогенеза, а также в области генетики и селекции пшеницы. Известен способ получения длительной регенерации растений,заключающийся в культивировании незрелых зародышей ячменя на среде В 5, дополненной БАП (0,01 мг/л), 30 г мальтозы, 1000 мг/л гидролизата казеина, 500 мг/л пролина и 50-кратной концентрацией меди,разработанный в университете Калифорнии (США)., 1998. Недостаток способа заключается в том, что он разработан для трех коммерчески важных сортов ячменя, и его не удалось воспроизвести при применении к другим сортам ячменя другим видам злаков. Также известен другой способ длительной регенерации растений, разработанный для трех сортов дикого злакав университете Льеж (Бельгия) ( . ., 1999). Способ достижения длительной регенерации заключается в индукции первичных каллусов из апексов побегов, последующем субкультивировании на среде МС с 2,4- Д, НУК и БА (цитокинина) (в течение недели) и затем - с целью регенерации растений,эмбриогенные участки переносят последовательно на среду МС без регуляторов роста(в течение 2-8 недель), на среду МС с активированным углем (в течение 2-8 недель), на среду МС с различными комбинациями НУК, ИУК,БА или ГА 3 (гибберелловой кислоты). В результате в течение 50 дней получаются растениярегенеранты. Недостатком этого способа получения длительно регенерирующих каллусов является то,что он разработан для трех сортов дикого злака и занимает много времени. Наиболее близким к заявляемому способу относится способ, где достигнуто преодоление генотипической зависимости процесса регенерации растений. Этот способ разработан в университете Флориды (США) под руководством (, , 1983). Способ заключается в культивировании незрелых зародышей пшеницы на среде МС с 2,4 Д) и удвоенной концентрацией минеральных элементов (макро и микроэлементов) среды МС (стресс) (-, , 1983) с образованием кратковременно культивируемых эмбриогенных каллусных тканей, способных к регенерации растений в течение короткого времени(1 субкультивирование). Участки каллусов с зачатками регенерации зеленых растений переносили на среду для регенерации без гормонов и нормальной концентрацией солей. Недостаток этого способа заключается в том, что регенерация растений у всех изученных генотипов этими исследователями получена в кратковременной культуре - из каллусов первого пассажа, лишь у одного генотипа достигнута длительная регенерация(в течение четырех лет) -, , 1983., 1990. Существенные признаки способа, совпадающие с признаками предложенного способа а) достигнута генотип-независимость 2 регенерации растений, б) общий объект исследования - пшеница, в) используется удвоение концентрации минеральных солей (макроэлементов) для индукции процессов морфогенеза. Задачей изобретения является разработка способа получения длительной регенерации растений универсального для различных сортов пшеницы. Технический результат достигается тем, что этот способ позволяет получать растения-регенеранты из длительно культивируемых эмбриогенных тканей пшеницы независимо от генотипа - не только у известных из литературы генотипов с высоким морфогенным потенциалом, но и у любых коммерчески важных сортов пшеницы. Разработана генотип-независимая биотехнология регенерации растений из многократно субкультивируемых тканей пшеницы. Способ получения,включающий культивирование в течение месяца глобулярных каллусов пшеницы на модифицированной среде Мурасиге и Скуга (МС), дополненной 2,4 Д (1,0 и 5,0 мг/л), удвоенной концентрацией минеральных элементов среды МС (стресс), 1000 мг/л гидролизатом казеина, 500 мг/л пролином и 30 г мальтозы,последующее субкультивирование(месяц) каллусов на той же среде с однократной концентрацией минеральных элементов среды МС,и формирование плотных эмбриогенных каллусов,эмбриогенный и регенерационный потенциал которых сохранялся в течение 10-12 пассажей. Пример 1. Для получения длительно регенерирующих тканей глобулярные каллусы пшеницы и рыхлые гетерогенные каллусы ячменя культивируют на модифицированной среде МС с 2,4-Д (1,0 и 5,0 мг/л) с удвоенной концентрацией минеральных солей (макроэлементов) МС (стресс),дополненной 30 г мальтозы, 1000 мг/л гидролизатом казеина (ГК) и 500 мг/л пролином. Глобулярные каллусы через 20-30 дней культивирования на этой среде претерпевают метаморфоз с образованием участков плотных эмбриогенных тканей. Пример 2. Через месяц плотные эмбриогенные каллусы отселектировали и перенесли на среду для МС с 2,4-Д (1,0 и 5,0 мг/л) и с обычной концентрацией макроэлементов среды МС (без стресса), дополненной 30 г мальтозы, 1000 мг/л ГК и 500 мг/л пролина. После снятия стрессового воздействия двухкратной концентраций макроэлементов происходит активная пролиферация эмбриогенных тканей, количество эмбриоидов и регенерирующих побегов увеличивается (фиг.1). ПЭ каллусы были получены у всех изученных сортов пшеницы и ячменя,однако их количественный выход был неодинаков в зависимости от генотипа и концентрации 2,4-Д в среде. Так, например, в культуре ткани пшеницы наилучшие показатели по частоте образования ПЭ каллусов на средах с обеими концентрациями 2,4-Д наблюдали у сортов Отан, , а наименьшие у сортов Казахстанская 15 и Казахстанская 25 В целом, выход ПЭ каллусов на среде с 1,0 мг/л 2,4-Д у всех сортов был выше (от 44,0 до 87,5),чем на с 5,0 мг/л 2,4-Д (от 19,7 до 46,7). На среде с 1,0 мг/л 2,4-Д ПЭ каллусы спонтанно формировали множество зеленых побегов, что дало возможность массового получения растенийрегенерантов (фиг.2). Несмотря на некоторые различия в частоте образования ПЭ каллусов у различных генотипов,эмбриогенный и регенерационный потенциал полученных тканей сохранялся в течение 10-12 пассажей у всех изучаемых сортов пшеницы и ячменя. Преимущества предлагаемого способа состоят в том, что он позволяет получать длительную регенерацию растений для широкого спектра сортов и линий пшеницы, что свидетельствует в пользу ее генотип-независимости. Разработан генотипнезависимый протокол стабильной регенерации растений из длительно культивируемых каллусов пшеницы, который может быть использован при проведении исследований по клеточной селекции для создания новых сортов, толерантных к наиболее опасным стрессовым факторам (засуха, засоление). Длительно культивируемые каллусные ткани способные к регенерации растений можно использовать в качестве реципиентной системы для генетической трансформации На основе результатов по длительной регенерации растений из ПЭ каллусов у всех изученных нами сортов пшеницы и ячменя нами разработан протокол стабильной регенерации растений при многократном пассировании тканей,который был также успешно апробирован на шести гибридных комбинациях пшеницы и на некоторых видах диких злаков полевица ( ,а) и житняк (ору ). Это означает,что разработанная система регенерации растений при длительном субкультивировании позволяет преодолеть различия между сортами, гибридами и видами внутри семейства Злаковых в способности к морфогенезу и является генотип - независимой. Следовательно, нами преодолены две трудности,имеющиеся при разработке клеточных технологий зерновых и диких злаков зависимость процессов морфогенеза от генотипа и потеря регенерационной способности при длительном субкультивировании каллусных тканей. Таблица 1 Частота образования плотных эмбриогенных каллусов пшеницы по отношению к количеству глобулярных тканей Сорта Отан Целинная ЗС Казахстанская 10 Казахстанская 15 Казахстанская 25 Акмола 2 выхода морфогенных каллусов 1,0 мг/л 2,4- Д 5,0 мг/л 2,4-Д 84,12,3 46,71,9 87,51,6 46,22,2 62,91,2 43,30,8 53,11,8 23,62,0 44,01,5 22,50,5 58,80,9 19,71,4 57,51,6 28,00,8 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения эмбриогенных каллусных тканей пшеницы способных к длительной регенерации растений,включающий культивирование в течение месяца глобулярных каллусов пшеницы на модифицированной среде Мурасиге и Скуга (МС), дополненной 2,4-Д удвоенной концентрацией минеральных солей(стресс), отличающийся тем, что дополнительно включают 1000 мг/л гидролизата казеина, 500 мг/л пролина с 30 г мальтозы, при этом проводят последующее субкультивирование каллусов на той же среде с однократной концентрацией минеральных солей среды МС, и формирование плотных эмбриогенных каллусов, эмбриогенный и регенерационный потенциал которых сохранялся в течение 10-12 пассажей.