Генетическая конструкция pET28c – для экспрессии рекомбинантного белка cagA Helicobacter pylori

(51) 12 15/00 (2006.01) 12 15/09 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА(57) Изобретение относится к биотехнологии,микробиологии и может быть использовано в медицине для разработки и производства диагностических тест-систем,позволяющих выявлять пациентов-носителей высокопатогенных-позитивных штаммов, а также контролировать эффективность проводимой терапии. Задачей изобретения является создание экспрессионного вектора на основе рЕТ 28 с для получения рекомбинантного белка гена. Генетическая конструкция рЕТ 28 с была получена путем создания экспрессионного вектора рЕТ 28 с несущего генбелка.(72) Кулмамбетова Гульмира Нигметжановна Ахметоллаев Ильяс Амирханович Кожахметов Самат Серикович Алмагамбетов Каиртай Хамитович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Республиканская коллекция микроорганизмов Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан Изобретение относится к биотехнологии,микробиологии и может быть использовано в медицине для разработки и производства диагностических тест-систем. Инфицирование бактериейвызывает развитие в слизистой оболочке желудка воспалительного процесса, что приводит к развитию хронического гастрита. До 20 инфекция приводит к возникновению острого гастрита, язвенной болезни, аденокарциномы желудка и лимфомы (., 2006). Патологические процессы, которые в большинстве случаев способствуют опухолевой трансформации,вызывают штаммы,продуцирующие цитотоксин( 2005). Этот белок является основным факторов патогенностии считается ответственным за нарушение целостности эпителия слизистой желудка,индукцию неконтролируемой пролиферации эпителиальных и лимфоидных клеток, секреции провоспалительных цитокинов и модуляцию презентации антигенов клетками эпителия (, 2008.,2009). Выявление антител крекомендовано в качестве первичной диагностики инфекции данным патогеном. По заключениюМаастрихтской конференции, для диагностики инфекции рекомендуется использовать комплекс иммунологических и молекулярно-биологических методов (., 2007., 2008., 2010). Генетическая конструкция 28 является основой для получения рекомбинантного белка, который служит основанием для разработки и производства диагностических тест-систем,позволяющих выявлять пациентов-носителей высокопатогенных -позитивных штаммов, а также контролировать эффективность проводимой терапии. Известна генетическая конструкция фирмыпроизводителя 30,позволяющая экспрессировать рекомбинантные фрагменты белка(////////). Недостатком данной генетической конструкции является ограничение в размере вектора и количестве векторной конструкции. Задачей изобретения является создание экспрессионного вектора на основе рЕТ 28 с для получения рекомбинантного белка гена. Генетическую конструкцию получали следующим образом Поиск нуклеотидной последовательности белка для создания экспрессионного вектора проводили с использованием баз данныхи. Анализ первичных структур проводился с использованием пакета программ. Проведение информационного анализа кодирующей последовательности генаДля получения вектора экспрессирующего рекомбинантный белокбыл проведенанализ гена кодирующего фактор вирулентности. По результатам анализа было показано, что генотличается большим полиморфизмом и для создания рекомбинантного белка необходимо подобрать вариант с высокой степенью комплементарности к полиморфным вариантам. Для этого была использована последовательность генадля штамма 99. Размер целевого гена составляет 3504 п.о. Для получения рекомбинантного белка, в ген также добавлен полигистидиновый фрагмент, который кодирует 6 молекул гистидина на С-конце целевого пептида. Рекомбинантный белок вместе с полигистидином состоит из 1195 аминокислотных остатков и имеет размер 133. Проведение сборки генадля сборки генабыли синтезированы олигонуклеотиды позволяющие провести синтез гена. Праймеры фланкирующие 5 и 3 концы гена несут сайты для рестриктази . Проведение работ по созданию экспрессионного вектора для генана основе рЕТ 28 с для получения рекомбинантного белка генабыла проведена работа по созданию экспрессионного вектора на основе рЕТ 28 с. На фиг.1 представлена схема экспрессионного вектора. Олигонуклеотиды заданной последовательности синтезировали на приборе 800 фосфоиммидным методом согласно Инструкции фирмы- производителя. Генетическая конструкция рЕТ 28 с для экспрессии рекомбинантного белка депонирована и хранится в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов(010000, г. Астана, ул. Валиханова,13/1) под регистрационным номером -0562. Генетическую конструкцию рЕТ 28 с - для экспрессии рекомбинантного белка используют следующим образом компетентные клеткиштамма 21 с трансформированной плазмидой культивируют в 1000 мл среды(пептон - 10 г дрожжевой экстракт - 5 г- 5 г рН-7,2-7,4 доводим 5 Мдистиллированная вода до 1 литра,канамицин - 50 мкг/мл), при температуре 37 С до 6000.5. Затем индуцируют экспрессию гена добавлениемв концентраций 0,2 мМ. После добавления индуктора клетки культивируют при 37 С и в течение 8 часов. После этого клетки собирали центрифугированием (3000 15 минут), промывали небольшим объемом охлажденногои разрушали ультразвуком с помощью дезинтегратора,следуя рекомендациям производителя прибора. Разделение белковой фракции проводили методом электрофореза в вертикальном полиакриламидном геле с концентрацией ПААГ от 5 до 10. Электрофорез проводили при комнатной температуре в трис-глициновом денатурирующем геле (25 шМ трис-глицин 8.3,0,1 ), при напряженности электрического поля 100 В/см в течение 110 мин. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Генетическая конструкция рЕТ 28 с - для экспрессии рекомбинантного белка, депонированная в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов- 0562, являющаяся основой для разработки и производства диагностических тест-систем.