Способ диагностики лизосомных болезней накопления

(51) 12 1/68 (2006.01) 01 33/68 (2006.01) 01 33/573 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ этанола, не относящегося к прекурсорам, для более качественного взаимодействия реактива с ферментами и полного осаждения неанализируемых фракций, предлагается добавить стоп-буфера с ферментами - -глюкоцереброзидаза , глюкозидаза , -галактозидаза , идуронидазы , сфингомиелиназа ,галактоцереброзидаза , только после этого центрифугировать. При снижении активности ферментов от показателей референсных значений,диагностируют лизосомные болезни накопления. Таким образом,предложенный способ диагностики лизосомных болезней накопления позволяет повысить точность диагностики лизосомных болезней накопления определять одновременно активность нескольких ферментов в одной лунке использовать менее токсичные реагенты, не относящиеся к прекурсорам разработать алгоритмы диагностики наследственных болезней обмена веществ,сопровождающихся нарушениями метаболизма использовать способ в практической медицине при проведении скрининга, что приведет к снижению инвалидизирующей патологии новорожденных применить различные терапевтические стратегии, и улучшить результаты лечения.(76) Абильдинова Гульшара Жусуповна Баянова Миргуль Файзуллиновна Камалиева Бакытгуль Омаровна Боровикова Анна Викторовна(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛИЗОСОМНЫХ БОЛЕЗНЕЙ НАКОПЛЕНИЯ(57) Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской генетике, неврологии,педиатрии, неонатологии. Данный способ может быть использован для диагностики лизосомных болезней накопления Гоше, Помпе, Фабри,мукополисахаридоза 1 типа, Ниманна-Пика, Краббе. Задачей изобретения является разработка способа диагностики лизосомных болезней накопления с целью проведения адекватной заместительной терапии. Способ диагностики лизосомных болезней Гоше,Помпе,Краббе,Фабри,Ниманна-Пика и мукополисахаридоза 1 типа состоит из следующих этапов преаналитический,аналитический и постаналитический. Отличием от известного способа является использование менее токсичного Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской генетике, неврологии, педиатрии,неонатологии. Данный способ может быть использован для диагностики лизосомных болезней накопления Гоше,Помпе,Фабри,мукополисахаридоза 1 типа, Ниманна-Пика, Краббе. Известен способ диагностики лизосомных болезней накопления. Метод состоит из нескольких этапов. Первая стадия - преаналитическая (2 этапа пробоподготовки 1 - забор исследуемого материала 2 - приготовление реакционной смеси. Вторая стадия - аналитическая (проведение массспектрометрического анализа (-/) на массспектрометре). Третья стадия - постаналитическая(интерпретация полученных результатов). Преаналитическая стадияэтап 1. Кровь берут из пятки на 1 -2 сутки жизни у доношенного и на 7 сутки день жизни у недоношенного ребенка. Забор крови осуществляют через 3 часа после кормления. 2. Взятие крови у новорожденного ребенка осуществляется только на специальные фильтровальные бумажные тест-бланки ( 903), которые выдаются врачами генетиками. 3. Перед взятием крови пятку ребенка необходимо протереть стерильным тампоном,смоченным 70 спиртом. Во избежание гемолиза крови обработанное место промокнуть стерильной сухой салфеткой. 4. Прокол делают одноразовым скарификатором и первую каплю крови снимают стерильным сухим тампоном. Глубина прокола не более 2,0 мм. 5. Мягким надавливанием на пятку способствуют накоплению второй капли крови, к которой перпендикулярно прикладывают специальный фильтровальный бумажный тест-бланк и пропитывают полностью и насквозь 4 пятен. Диаметр пятен должен быть не менее 12 мм, вид пятен должен быть одинаков с обеих сторон.этап 1.Из пятен крови панчером выбивается по две копии диска размером 3.2 мм в 96 луночную полипропиленовую плашку,регистрационный номер образцов вносятся в таблицу. 2.В каждую лунку плашки добавляют по 70 мкл 20 мМоль/л фосфатный буфер ( 7,1) и шейкируют при 37, 225 об/мин в течение 1 ч. 3. Ферментативную реакцию проводят в плашках с добавлением 15 мкл коктейля, состоящего из ,иферментов и 10 мкл полученного экстракта крови. Инкубируют при 37 в течение 20-24 часов. 4. После инкубации через 24 часа плашку центрифугируют при 4000 об/мин, в течение 2 мин. 5. Для остановки ферментативной реакции добавляют по 100 мкл 50 раствора этилацетатметанола в разведении 11 (20 мл метанола 20 мл этил ацетата). 6. Для определения активности фермента смесь субстратов переносят в одну глубоколуночную плашку. Смесь тщательно ресуспензируют. 7. Для промывки в каждую лунку вносят по 400 мкл этилацетата и 400 мкл Н 2 ,центрифугируют при 4000 об/мин в течение 8 мин. После центрифугирования образуется две фазы 1 верхняя - этилацетат 2- нижняя- Н 2 . 10. В чистую глубоко луночную плашку переносят 300 мкл этилацетата (верхняя фаза),ставят в Эвапаратор на 20-30 мин. до образования сухого мутного осадка. 11. Проводят дальнейшую промывку 100 мкл 95 раствором этилацетатметанола (19 этилацетата 1 метанола) и шейкируют 500 об/мин в течение 5 мин. 12. В плашку с фильтром вносят по 100 мкл селикогеля и добавляютпо 250 мкл 95 раствора этилацетатметанола и по 150 мкл пробы и помещают в вакуумный манифолд (давление до 0,5 атм). Процедуру повторяют 2-3 раза. 13. Полученный субстрат помещают в Эвапаратор до полного выпаривания этилацетатметанола. Полипропиленовую плашку с сухим веществом закрывают фольгой и хранят при-20. Аналитическая стадия заключается в проведении жидкостной хроматографии массспектрометрического анализа (-/) на массспектрометре. Постаналитическая стадия заключается в определении концентрации активности ферментов(-глюкоцереброзидазы,сфингомиелиназы,глюкозидазы,галактоцереброзидазы,галактозидазы, -идуронизады) и определяется как отношение относительного содержания ионов продукта к внутреннему стандарту, в зависимости от времени инкубации и объема образца. Появление продуктов прямо пропорционально энзиматической активности у новорожденных по сравнению с контрольными показателями. Метод тандемной масс-спектрометрии направлен на измерение активности ферментативного статуса организма. В основе многих наследственных болезней лежат дефекты разнообразных ферментов,связанных с изменением их структуры вследствие мутаций генов,кодирующих синтез соответствующих ферментов. Внедрение метода тандемной масс-спектрометрии диагностики дефектных ферментов,накапливающихся в промежуточных продуктах обмена в клетке и биологических жидкостях организма и других биохимических соединениях, обладает высокой чувствительностью,позволяет одновременно определить активность нескольких ферментов с одного пятна, что дает возможность значительно сократить время исследований,расширить представления о сущности наследственных болезней и определить базу для разработки терапевтических подходов к их коррекции.(Байдакова Г.В., Букина , Гончаров В.М. и др.//Медицинская генетика,2005. - Том 4, 1. - с. 2832). Совпадающими признаками являются аналитическая и постаналитическая стадии. Отличительным признаком от аналога является преаналитическая стадия. Недостатком известного способа является то, что в известной методике в преаналитической части используется метанол,который является прекурсором (т.е. ядом). После инкубации через 24 часа плашку центрифугируют,затем для остановки ферментативной реакции добавляют стоп-буфер. Новизной предлагаемого способа является- использование этанола вместо метанола,который является прекурсором (ядом)- для более качественного взаимодействия реактива с ферментами и полного осаждения неанализируемых фракций, предлагаем вначале добавить стоп-буфер,а затем проводить центрифугирование. Задачей изобретения является разработка способа ранней и эффективной диагностики лизосомных болезней накопления в раннем постнатальном периоде с целью проведения адекватной заместительной терапии. Таким образом,предложенный способ диагностики лизосомных болезней накопления позволяет- повысить точность диагностики лизосомных болезней накопления определять одновременно активность нескольких ферментов с одного пятна- использовать менее токсичные реагенты, не относящиеся к прекурсорам (ядам)- использовать способ в практической медицине при проведении скрининга, что приведет к снижению инвалидизирующей патологии новорожденных- разработать алгоритмы ранней диагностики наследственных болезней обмена веществ,сопровождающихся нарушениями метаболизма Пример 1 Новорожденному, на 2 день жизни на фильтровальные бумажные тест-бланки из пятки взята кровь. Методом масс-спектрометрии проведен анализ активности ферментов , , и . Было выявлено снижение активности фермента а-идуронидазы- 33,06/20 (норма 450-2614 /20). В результате был поставлен клинический диагноз Мукополисахаридозтипа. Своевременно выставленный диагноз позволил начать адекватную заместительную терапию. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики лизосомных болезней накопления, включающий исследование сухих пятен крови методом тандемной масс-спектрометрии,отличающийся тем, что в преаналитической стадии вместо метанола используют менее токсичный этанол, и, при снижении активности ферментов от показателей референсных значений, диагностируют лизосомные болезни накопления.