Штамм бактерий Bacillus subtilis Zb52, предназначенный для биочистки сточных вод

(51) 12 1/20 (2006.01) 12 9/56 (2006.01) 12 1/125 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, к получению штамма бактерий,обладающего высокой биодеструктирующей активностью и предназначенного для биоочистки сточных вод. Задача изобретения заключается в получении нового штамма бактерий микроорганизма с высокой липолитической и протеолитической активностью. Штамм бактерий 52 отличается высокой протеолитической,липолитической и липазной активностью. Для усиления липазной активности штамма оптимальными являются следующие факторы внесение в состав питательной среды 2 оливкового масла,среды - 10,0, температура культивирования - 30 С, продолжительность культивирования - 24 часа.(72) Сармурзина Зинигуль Сериковна Ануарбекова Сандугаш Сакеновна Кулмамбетова Гульмира Нигметжановна Алмагамбетов Каиртай Хамитович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Республиканская коллекция микроорганизмов Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ 52,ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ БИОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, к получению штамма бактерий,обладающего высокой биодеструктирующей активностью и предназначенного для биоочистки сточных вод. Известен штамм бактерий 1719 продуцент антагонистически активной биомассы в отношении болезнетворных микроорганизмов, а также протеолитических, амилолитических и липолитических ферментов (Патент 298032). Штамм бактерий антагонистически активен в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов , , , . Способен утилизировать глюкозу, ксилозу, маннит, сахарозу,мальтозу и эскулин. Продуцирует ферменты липазу, протеазу, амилазу. Недостатком известного штамма бактерий является неизученность липолитической активности по отношению к животным жирам и твинам, что не позволяет оценить его жиродеструктирующую способность по отношению к жирозагрязненным сточным водам. Известен штамм бактерий- один из наиболее сильных продуцентов протеазы(Патент 2208633). Недостатком известного штамма бактерий является отсутствие липолитической активности по отношению к жирам сточных вод, а также длительность процесса культивирования и необходимость его выращивания на дорогостоящих питательных средах, включающих нестандартные пищевые компоненты. Задача настоящего изобретения заключается в получении нового штамма бактерий микроорганизма с высокой липолитической и протеолитической активностью. Технический результат достигается предлагаемым штаммом бактерий 52, выделенным из растительных остатков. Это грамположительные палочки, 0,4-2 мкм,удлиненные,с закругленными концами,расположены одиночно, длинными цепочками,скоплениями. Образует эллипсовидные эндоспоры,расположенные субтерминально. На агаризованных плотных средах -г,Громыко, МПА образует колонии неправильной формы, диаметром 3-5 мм, морщинистые, плоские,матовые, бесцветные или белого цвета, с неровными краями,однородной структуры,мягкой консистенции. На сусло-агаре образует колонии неправильной формы, диаметром 2- 3 мм, гладкие,плоские с выпуклым центром, матовые, коричневого цвета с ровными краями, однородной структуры,мягкой консистенции. На жидких средах -бульон и пептонный бульон наблюдается слабое помутнение бульона, образуется тонкая складчатая пленка,пристеночное кольцо, скудный и умеренный хлопьевидный осадок. Культура каталазо- и оксидазоположительна. Расщепляет ксилозу, фруктозу, маннозу и сахарозу до кислоты. Гидролизует казеин, мочевину и крахмал. Реакция Фогес-Проскауэра положительная. 2 Редуцирует метиленовую синь. Растет на питательной среде, содержащей 5-10 ,температура инкубирования возможна в диапазоне 5-45 С. Фенилаланин не дезаминирует, тирозин не разрушает, индол и сероводород не образует. Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16 рРНК штамма бактерий 52 Достоверность составляет 100 при сравнении с известными последовательностями дляво Всемирной базе данных . По вышеизложенным морфологокультуральным,физиолого-биохимическим свойствам и типированию по гену 16 рРНК штамм бактерий типичен для вида. Культура штамм бактерий 52 депонирована в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов под номером 0285,хранится методами лиофилизации и криоконсервации. Для выявления протеолитической активности использован молочный агар - среда, состоящая из равных частей стерильного обезжиренного молока и стерильного 3-го водного агара. Перед приготовлением среды молоко обезжиривали кипячением и стерилизовали при 0,5 атмосфере в течение 15 минут. После стерилизации его подогревали и добавляли при постоянном помешивании к стерильному расплавленному и остуженному до 50 С водному агару. Полученную среду разливали в стерильные чашки Петри, затем высевали микроорганизмы уколом или бляшками. Продолжительность культивирования при 37 С от 2 до 10 суток. Гидролиз казеина обнаруживали по зоне просветления среды вокруг колонии или выросших по штриху микроорганизмов. Особенно четко она видна после обработки среды 5-м раствором трихлоруксусной кислоты. Зону гидролиза казеина измеряли в миллиметрах от края штриха или колонии до границы светлой зоны. Она составила 12 мм,что свидетельствует о высокой протеолитической активности штамма бактерий и перспективности его использования для утилизации белковых загрязнений. Липолитическая активность штамма бактерий по отношению к животным жирам (бараний, говяжий и свиной) определена на минеральной среде Раймонда(г/л) 43-1,0 К 2 НРО 4-1,0 КН 2 Р 4-1,0 40,2 СаС 12 Н 2-0,02 4-0,002 дрожжевой экстракт - 1,0 дистиллированная вода - 1,0 л. Среда предварительно простерилизована при 1,1 атмосфере в течение 15 минут. Жиры вносили в стерильную среду Раймонда (100 мл) раздельно по 1 г, инокулировали культуру штамма бактерий 52. Культивирование проводили в колбах на 250 мл в течение 7 суток при 37 С и 100 об/мин на шейкере-инкубаторе. По истечении срока инкубации остаточное содержание жиров определяли весовым методом после экстракции гексаном. Штамм бактерий расщеплял бараний жир на 83, говяжий - на 88, и свиной - на 91. Для определения липазной активности штамма бактерий ферментацию проводили в колбах на 250 мл со средой для продукции липазы (100 мл),инокулированной 5 суточной культурой. Среда для продукции липазы 0,01 4, 0,1 КН 2 Р 4,1 твин-20, 0,2 глюкозы, 0,5 пептона ( 7,0). Стерилизация среды при 0,5 атмосфере - 15 мин. Культивирование проводили при 37 С в течение 24 часов при 150 об/мин на шейкере-инкубаторе. После ферментации супернатант центрифугировали при 4000 об/мин - 15 мин на центрифуге. Реакционную смесь, содержащую 0,1 мл 10 твин-20, твин-60,твин-80 (соответственно лауриловой, стеариновой и олеиновой жирных кислот) в 50 мМ -буфере ( 7,6), 0,1 мл 1 М СаС 12 в -буфере, 0,5 мл супернатанта культуры и 2,3 мл -буфера,инкубировали при 37 С в течение 2 часов. Измерение проводили на спектрофотометре при длине волны 400 нм. За единицу липазной активности принимали количество фермента,приведшего к увеличению оптической плотности при 400 нм на 0,01. Липазную активность выражали числом единиц активности фермента, приходящихся на 1 мг общего белка. Штамм бактерий проявил высокую липазную активность 213,732,28 к твину 20 270,85,44 к твину-60 и 248,214,2 к твин-80(Ед/мг белка, М). Таким образом, высокая протеолитическая и липолитическая активность штамма бактерий выявлена при культивировании на простых питательных средах - мясопептонный агар и пептонный бульон. Вместе с тем определены дополнительные компоненты питательной среды, усиливающие продукцию липазы. При добавлении в питательную среду сахарозы продукция липазы увеличивается на 33. Введение азотсодержащих соединений, в частности, дрожжей белкововитаминного концентрата или желатины увеличивало липазную активность на 15-37. Максимальная липазная активность достигается путем введения оливкового масла, увеличивающего липазную активность до 180,0. Определены оптимальные условия культивирования,усиливающие липазную активность штамма. Она достигает максимума присреды равным 10,0 по отношению к твину-20 достигает 180,6 к твину-60 - 160,0 и к твину-80 179,6 (Ед/мг общего белка). Максимальная липазная активность отмечена на 24 часу культивирования,при температуре культивирования равной 30 С. При разработке биопрепарата на основе сообщества биологически активных штаммов бактерий с целью очистки сточных вод в его основе рекомендуется использовать штамм бактерий 52. Штамм бактерий 52 отличается от раннее выделенных высокой протеолитической, липолитической и липазной активностью. Для усиления липазной активности штамма бактерий оптимальными являются следующие факторы основная питательная среда,дополнительно содержащая 2 оливкового масла, среды - 10,0, температура культивирования 30 С, продолжительность культивирования-24 часа. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерий 52,депонированный в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов МОН РК под номером--0285, предназначенный для биочистки сточных вод.