Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa Zb32, обладающий липазной активностью

(51) 12 1/385 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) 12 15/78 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ предназначенного для очистки сточных вод от жировых отложений. Штамм бактерий 32 отличается от известных штаммов бактерий высокой липазной активностью, оптимальными условиями культивирования являются 7,0,температура 35 С, шуттелирование при 50 об/мин. Для биологической очистки жировых отложений в сточных водах применяется не один, а сообщество активных штаммов бактерий. Штамм бактерий 32 с высокой липазной активностью, отличающийся от известных штаммов бактерий условиями культивирования, а именно,способностью проявлять высокую липазную активность в нейтральной среде и при 35 С,перспективен при разработке биопрепаратов с жиродеструктирующей активностью. Штамм бактерий 32 рекомендуется в качестве основы биопрепарата для очистки сточных вод от жировых отложений.(72) Сармурзина Зинигуль Сериковна Ануарбекова Сандугаш Сакеновна Кулмамбетова Гульмира Нигметжановна Алмагамбетов Каиртай Хамитович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Республиканская коллекция микроорганизмов Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, к получению штамма бактерий,обладающего высокой липазной активностью и предназначенного для очистки сточных вод от жировых отложений. Известен липолитически активный штамм бактерийИБ 2-2, выделенный из активного ила аэротенка биологических очистных сооружений мясокомбината г. Перми (патент 2310685). Для определения липазной активности штамм бактерийИБ 2-2 выращивали в колбах на качалке при 200 об/мин,объем среды 100 мл. Состав питательной среды соевая мука - 5 дрожжевой экстракт - 60 К 2 НР 4 5,0 (4)24-1,0 среды - 7,0. Показана высокая липолитическая активность штамм бактерий по отношению к кулинарному, свиному и говяжьему жирам. Недостатком известного штамм бактерий является отсутствие данных по липолитической активности к бараньему жиру, к твину-20, твину-60,твину-80. Прототипом изобретения является штамм бактерий 23 (Патент РК 26272). Штамм бактерий выделен из сточных вод мясокомбината, г. Астана и характеризуется следующими морфологическими признаками. Клетки грамотрицательные, подвижные, прямые или изогнутые палочки с закругленными концами 15 0,5-1,0 мкм. При культивировании среда окрашивается в сине- зеленый цвет и на ее поверхности появляется пленка. Оптимальная температура роста 37 С. Штамм идентифицирован по фенои генотипическим характеристикам,выявлена следующая последовательность фрагмента гена 16 рРНК.. Штамм характеризуется высокой липолитической активностью по отношению к жирам животного происхождения. Для оценки липолитической активности в среду Раймонда вносился инокулят штамма, а также дополнительно говяжий, бараний и свиной жиры по 1 г. Проводилось инкубирование питательной среды в течение 7 суток при 37 С и 150 об/мин на шейкереинкубаторе. Остаточное содержание жиров оценивалось весовым методом. Штамм проявил высокую липолитическую активность (расщепление в ) говяжий до 89, бараний - до 91 и свиной до 95. Липолитическая активность штамма оптимальна при следующих условиях культивирования время инкубирования 24 часа,температура 37 С,9.0, шуттелирование 150 об/мин. Недостатками известного штамма является невысокая липазная активность по отношению к твину-20, твину-60- и твину-80, определявшаяся на спектрофотометре. Она равнялась 191,6234,06,371,0613,05 и 224,1564,58 (Ед/мг белка, М),соответственно. Оптимальная липолитическая активность проявляется только в щелочных условиях, при 9,0 и температуре 37 С. Задача настоящего изобретения заключается в получении нового штамма бактерий, с высокой липазной активностью. Изобретение представляет собой штамм бактерий 32, обладающий высокой липазной активностью по отношению к жирам животного происхождения и твинам жирных кислот. Штамм выделен из суспензии почвы, на питательной среде следующего состава пептон ферментативный сухой для бактериологических целей - 9,0 г гидролизат казеина ферментативный,глубокой степени расщепления - 8,0 г дрожжевой экстракт - 3,0 г хлорид натрия - 5,0 г натрий гидроортофосфат - 2,0 г агар микробиологический 10 г(7,20,2). Штамм депонирован в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов под номером 0284, хранится методами лиофилизации и криоконсервации. Это грамотрицательные палочки,с закругленными концами, расположены одиночно либо скоплениями. На агаризованных плотных средах -г, Громыко и МПА образует колонии круглой формы, диаметром 2-3 мм, гладкие,плоские, блестящие светло-коричневого цвета с ровными краями, однородной структуры, мягкой консистенции. На сусло-агаре колонии круглой формы, точечные, гладкие, плоские, блестящие светло-коричневого цвета, с ровными краями,однородной структуры, мягкой консистенции. На жидкой среде -бульон наблюдается умеренное помутнение бульона, а на питательном бульоне наблюдается сильное помутнение среды, образуется рыхлая пленка. Реакция на каталазу положительная, на оксидазу отрицательная. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, редуцирует метиленовую синь. Растет при 5, 7 и 10-ной концентрации . Ферментирует фруктозу,ксилозу,маннозу,сорбитол, мальтозу, манит, гидролизует мочевину,казеин и крахмал Фенилаланин не дезаминирует,тирозин не разрушает, индол и сероводород не образует. Штамм бактерий имеет типичные для вида культуральноморфологические и физиолого-биохимические характеристики. Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16 рРНК штамм бактерий 32 Достоверность составляет 98 при сравнении с известными последовательностями дляво Всемирной базе данных . В лабораторных условиях на модельных растворах изучена липолитическая и липазная активность штамма бактерий 32 по отношению к животным жирам и к твинам жирных кислот соответственно 1. Липолитическая активность штамма бактерий по отношению к животным жирам (бараний,говяжий и свиной) определяли на минеральной среде Раймонда (г/л) 43 - 1,0 К 2 НР 4 - 1,0 КН 2 Р 4 - 1,0 4 - 0,2 СаС 12 хН 2 - 0,02 4- 0,002 дрожжевой экстракт - 1,0 дистиллированная вода 1,0 л. Среда предварительно простерилизована при 1,1 атмосфере в течение 15 минут. Жиры вносили в стерильную среду Раймонда(100 мл) раздельно по 1 г, инокулировали культуру 32. Культивирование проводили в колбах на 250 мл в течение 7 суток при 37 С и 100 об/мин на шейкере-инкубаторе. По истечении срока инкубации остаточное содержание жиров определяли весовым методом после экстракции гексаном. Данные представлены на таблице 1. Таблица 1. Липолитическая активность Штамм бактерий бараний 67 твин-80 (соответственно лауриловой, стеариновой и олеиновой жирных кислот) в 50 мМ -буфере ( 7,6), 0,1 мл 1 М СаС 12 в -буфере, 0,5 мл супернатанта культуры и 2,3 мл -буфера,инкубировали при 37 С в течение 2 часов. Измерение проводили на спектрофотометре на длине волны 400 нм. За единицу липазной активности принимали количество фермента,приведшего к увеличению оптической плотности при 400 нм на 0,01. Активность выражали числом единиц активности фермента, приходящихся на 1 мг общего белка (таблица 2). Таблица 2. Липазная активность 2. Для определения липазной активности ферментацию проводили в колбах на 250 мл со средой для продукции липазы (100 мл),инокулированной 5 суточной культуры. Среда для продукции липазы 0,01 4, 0,1 КН 2 Р 4, 1 твин-20, 0,2 глюкозы, 0,5 пептона ( 7,0). Стерилизация среды при 0,5 атмосфере - 15 мин. Культивирование проводили при 37 С в течение 24 часов при 150 об/мин на шейкере-инкубаторе. После ферментации супернатант центрифугировали при 4000 об/мин - 15 мин на центрифуге. Реакционную смесь, содержащую 0,1 мл 10 твин- 20, твин-60, Штамм бактерий 32 Проведена оптимизация состава питательной среды путем внесения дополнительных органических субстратов с целью повышения липолитической активности штамма бактерий 32. Установлено увеличение активности на 70-80 при добавлении в питательную среду оливкового масла, на 30-46 при внесении дрожжевого или мясного экстрактов,на 10-12 при введении сахарозы и мальтозы. Оптимизированы условия культивирования наиболее высокая липолитическая активность штамма бактерий отмечена через 24 часа культивирования. Динамику накопления фермента липазы в культуральной жидкости исследуемых штаммов бактерий определяли,выращивая микроорганизмы в суспензионной культуре в течение 30 часов и, отбирая пробы на различных стадиях роста через каждые 3 часа. Согласно полученным результатам было выявлено, что 3 динамика накопления липазы в культуральной жидкости у штамма бактерий 32,начинается на 3 часу культивирования и достигает максимума на 24 часу инкубации. Выявлено,что накопление липазы в культуральной жидкости достигает максимума при температуре культивирования 35 С. При более высоких температурных режимах культивирования наблюдалось снижение ферментативной активности. Липазная активность оценивалась путем культивирования штамма бактерий в питательной среды,которой варьировал от 4,0 до 9,0. Оптимум липазной активности наблюдается присреды 7,0. Штамм бактерий 32 отличается от известных штаммов бактерий высокой липазной активностью, оптимальными условиями культивирования являются 7,0,температура 35 С, шуттелирование при 50 об/мин. Для биологической очистки жировых отложенйй в сточных водах применяется не один, а сообщество активных штаммов бактерий. Штамм бактерий 32 с высокой липазной активностью, отличающийся от известных штаммов бактерий условиями культивирования, а именно,способностью проявлять высокую липазную активность в нейтральной среде и при 35 С,перспективен при разработке биопрепаратов с жиродеструктирующей активностью. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерий 32,депонированный в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов МОН РК под номером