Штамм бактерий Bacillus subtilis, разлагающий простые и комплексные цианиды пульпы

(51)7 12 1/20, 02 3/34 // (12 1/20, 12 1125) ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(72) Абдрашитова Светлана Анваровна Илялетдинов Альфарид Низамович Толмачева Елена Владиленовна Розвага Роман Иванович Клец Александр Николаевич Давыдов Георгий Иванович Прохорова Светлана Вениаминовна Абдуллина Гульзия Габдулловна(73) Государственное научно-производственное объединение промышленной экологии Казмеханобр(57) Изобретение относится к области биотехнологии и экологии и касается нового штамма бактерий,который может быть использован для очистки пульпы от простых и комплексных цианидов металлов на предприятиях цветной металлургии, гальванических и коксохимических производствах и золотоискательных фабриках. Штамм бактерийИМиВ-В-10 разлагает простые и комплексные цианиды пульпы. Штамм обладает высокой толерантностью к ионам тяжелых цветных металлов, сокращает время разложения цианидов, обладает высокой степенью иммобилизации на твердых пористых носителях. Очищенная с помощью предложенного штамма вода пригодна для сброса в открытые водоемы. 8289 Изобретение относится к областям биотехнологии и экологии и касается нового штамма бактерий,который может быть использован для очистки пульпы от простых и комплексных цианидов металлов на предприятиях цветной металлургии, гальванических и коксохимических производствах и золотоизвлекательных фабриках. Известен штамм бактерий 661-М 2 (а. с. СССР 895096, кл. С 12 15/00,1987), устойчивый к цианидам с концентрацией до 100 мг/дм 3, который способен разрушать цианиды в сточных водах с концентрацией до 70 мг/дм 3 в течение 4-6 суток. Недостатком штамма является то, что он разлагает только простые цианиды металлов и непригоден для биодеградации комплексных цианидов тяжелых цветных металлов пульпы, для полного разрушения цианидов требуется относительно много времени (от 3 до 6 суток), кроме того, штамм способствует биоразложению цианидов в довольно узком интервале концентраций (до 70 мг/дм 3). Известен также штамм бактерийВКМ В-1838 , разлагающий лишь простые цианиды (натрия, калия либо аммония), устойчивый к ним при концентрации до 1000 мг/дм 3, который способен разрушать цианиды в сточных водах при концентрации до 250 мг/дм 3 в течение трех суток(патент РК 2485, кл. С 12 1/20, 1995). Недостатком является то, что штамм бактерий разлагает исключительно лишь простые цианиды металлов в сточных водах и вовсе непригоден для биодеградации огромного арсенала комплексных цианидов тяжелых цветных металлов пульпы для полного разрушения цианидов требуется относительно много времени (от 3 до 6 суток) штамм способствует биоразложению цианидов в довольно узком интервале концентраций (до 250 мг/дм 3). Задача изобретения - получение нового штамма бактерий, обладающего способностью разлагать как простые, так и комплексные цианиды металлов пульпы с большой скоростью и в широком диапазоне концентраций. При этом достигается следующий технический результат- новый штамм бактерий обеспечивает устойчивость к простым и комплексным цианидам металлов пульпы при их концентрации до 500 мг/дм 3- достигается высокая степень иммобилизации клеток биомассы штамма твердыми пористыми носителями (40-84 )- способен полностью разлагать как простые, так и комплексные цианиды многообразных тяжелых цветных металлов со степенью очистки пульпы до 100- позволяет сократить время полного разложения цианидов в 2,4-288 раз (время биоочистки пульпы 15 мин - 2,5 суток)- обладает высокой толерантностью по отноше 2 нию к ионам тяжелых цветных металлов пульпы,мг/дм 3 С 2 - 35,0 2 - 5,0 2, 3 - 6,0 2 3,0 6 - 1,5 2 - 2,0. Поставленная задача была достигнута выделением и идентификацией нового штамма бактерийИМиВ-В-10, разлагающего простые и комплексные цианиды пульпы. Штамм депонирован в Музее культур Института микробиологии и вирусологии МН-АН РК под коллекционным номером ИМиВ-В-10 с приоритетом от 30.06.94 г. Сущность изобретения заключается в воздействии на пульпу новым штаммом бактерийИМиВ-В-10, способным очищать ее от простых и комплексных цианидов металлов при их концентрации до 350 мг/дм 3 с относительно большой скоростью, устойчивого к цианидам при концентрации до 500 мг/дм 3 и обладающего высокой степенью иммобилизации на твердых пористых носителях в пределах 40-84 . Существенными отличиями заявляемого объекта от прототипа являются следующие новый штамм бактерийИМиВ-В-10 разлагает не только простые, но и комплексные цианиды тяжелых цветных металлов, способен разлагать более высокие концентрации цианидов (до 350 мг/дм 3),обладает высокой толерантностью к тяжелым цветным металлам и значительно сокращает сроки полного разложения цианидов. Положительный эффект при воздействии штамма бактерий на загрязненные объекты достигается вследствие совокупности его культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств. Эффективность использования штамма бактерийИМиВ-В-10 подтверждена путем проведения производственных испытаний по биоочистке пульпы на Карамкенском горно-металлургическом комбинате (Российская Федерация),при этом степень очистки от простых и комплексных цианидов (их содержание в пульпе составляло,соответственно, 15 и 85 ) достигала 100 . Штамм бактерий выделен из илов и хвостов Карамкенского ГМК и Акбакайской золотоизвлекательной фабрики (РК). Культурально-морфологические признаки Клетки палочковидные, прямые с размерами 0,50,7 х 2-5 мкм, одиночные или соединены попарно. Подвижные, жгутики латеральные. Грамположительные. Спорообразующие. Споры эллиптические,без раздутости спорангия. При росте на рыбном питательном бульоне (РПБ) наблюдается помутнение,осадок и беловатая пленка, на твердой среде вырастают беловатые, гладкие, круглые и слегка выпуклые колонии. Физиолого-биохимические признаки Аэроб, хеморганотроф. Метаболизм дыхательный, в аэробных условиях в качестве конечного источника электронов используют кислород. В условиях факультативного анаэробиоза способны восстанавливать нитраты до нитритов. При росте на РПБ образуют сероводород и аммиак. 8289 Бактерии утилизируют К 3, (4)24, пептон,мочевину и аспарагин как источники азота. Из источников углерода бактерии используют при подкислении среды глюкозу, сахарозу, дульцит,мальтозу, ксилозу, арабинозу, раффинозу и маннит. Образуют каталазу. Тирозин не разлагают. Крахмал гидролизуют слабо. Внутриклеточные гранулы, не окрашиваемые фуксином, в клетках не встречаются. Максимальная температура роста - 45 С, минимальная - 10 С. Оптимальная температура роста 25-30 С. Бактерии способны к автотрофному росту в среде с цианидами в широком диапазоне рН 6,5-12,0, однако оптимальные условия процесса при рН 7,5-9,5. Обладая олигокарбофильными свойствами, в аэробных условиях бактерии могут использовать следовые количества органических веществ. Посредством биохимических процессов бактерии превращают комплексные цианиды в простые, которые вследствие бактериального окисления образуют малотоксичные цианиты соответствующих металлов. Культура .невирулентна и нетоксична,т. е. непатогенна для теплокровных животных. Условия хранения штамма Штамм бактерий хранят на агаризованной или жидкой средах с цианидом при 4 С. Его пересевы на свежие косяки с питательной минерализованной средой проводят раз в месяц. Пример 1, относящийся к получению накопительной и чистой культур штамма бактерийИМиВ-В-10. Используют жидкую либо агаризованную (2 агара) минерализованную среду,г/дм 3 К 2 НРО 4 - 0,5 424 - 0,5 472 0,25 цианид натрия, калия либо аммония - 200-300 вода - до 1000 см 3. Среду засевают небольшим количеством проб илов, хвостов либо пульпы и инкубируют в термостате при температуре 28-30 С,рН 8,0-9,0 с аэрацией воздухом (удельные расходы 5,0 мд 3/дм 2 ч) в течение 5-7 суток. Посредством последовательных пересевов частей инкубированной смеси в свежеприготовленную минерализованную среду получают чистую культуру штамма бактерий. Идентифицируют с использованием определителя Берги. Пример 2, относящийся к культивированию биомассы штамма бактерий .ИМиВ-В-10. В бак с мешалкой наливают 10,2 дм 3 дистиллированной воды и прибавляют одноразово 2,65 г К 2 НРО 4 2,59 г 424 2,59 г 472 2,3 г . Смесь подвергают перемешиванию до полного растворения компонентов. Полученную среду смешивают в ферментаторе с 10,2 дм 3 инокулята штамма бактерий .ИМиВ-В-10 с рабочим титром 108 кл/мл. Затем смесь подвергают непрерывной аэрации воздухом (удельные расходы - 15 мд 3/дм 2 ч) при температуре 30 С в течение 48 часов. При определении химико-аналитическими методами цианид-анион в среде отсутствовал. Титр полученной биомассы равен титру исходного инокулята штамма. Пример 3, относящийся к очистке пульпы с применением сорбента - полиакриламидного волокна. В проточный биореактор емкостью 250 мл помещают синтетические нити вии, предварительно промытые водой, и 150 мл инокулята штамма бактерийИМиВ-В-10 (титр - 108 кл/мл). После экспозиции в течение одних суток и удаления жидкой части (титр - 103 кл/мл) степень иммобилизации клеток сорбентом составляет 40 . Имитат осветленной пульпы (общее содержание простых и комплексных цианидов - 35 мг/дм 3) объемом 150 мл с рН 8,5 вносят в указанный биореактор, содержащий нити вии с иммобилизованными клетками штамма, и после экспозиции в течение одних суток посредством капельницы регулируют подачу в биореактор жидкой минерализованной среды (состав как в примере 1, но без цианидов). После удаления из последнего 30 мл имитата устанавливают соответствующий проток среды. Степень полной очистки имитата от цианидов (100 ) достигается в течение 4 суток. При тех же условиях опыта и при поддержании в биореакторе, обеспеченном водяной рубашкой, температуры 28-30 С время полной биодеградации цианидов достигает 2,5 суток. Пример 4, относящийся к очистке реальной пульпы с применением сорбента - колец Рашига. В проточный биореактор емкостью 200 мл помещают керамзитные кольца Рашига и заливают их 150 мл реальной осветленной пульпы с рН 9,5 состава,мг/дм 3 2 - 5,7 2 - 1,1 2, 3 - 0,73 2 0,1 6 - 0,15 1, 3 - 0,025 1 - 1,65 2 - 0,08 -1 - 281. Через одни сутки посредством капельницы путем дробной замены дозировали исходную пульпу при температуре 20-22 С. По истечении 4 суток цианиды в среде полностью отсутствовали. В тех же условиях опытов при температуре 28-30 С полное разложение цианидов достигается в течение двух суток. Пример 5, относящийся к очистке пульпы с применением анионита АМ-2 Б. В сорбционную емкость объемом 100 дм 3 помещали 0,1 кг хлороформы шарикообразного анионита АМ-2 Б (средний размер пор - 2-5 мкм) и 5,0 дм 3 реальной пульпы с рН 10,8 состава, мг/дм 3 С-1 - 219,0- 2,2 2 - 0,07 2 - 10,0,- 0,5 1, 3 - 0,3 1 - 1,0 2,3 - 1,6. Смесь подвергали перемешиванию посредством аэрации воздухом в течение 12 часов. После отстаивания и удаления фильтрата степень сорбции цианидов составляла 84 . В проточный биореактор емкостью 250 мл при температуре 20-23 С помещали 5 г сорбированного цианидами металлов анионита и 200 мл инокулята штамма бактерий .с рабочим титром 106 кл/мл. После одних суток и удаления жидкой части дозировали осветленную пульпу при аэрации смеси воздухом (5 дм 3/дм 2 ч) при температуре 2728 С (термостатирование). В течение двух суток цианиды полностью разлагались. Пример 6, относящийся к очистке пульпы с при 3 8289 менением сорбента - полистирола. В специальную фильтрующую установку (воронка Бюхнера со сменной округлой пластинкой из полистирола, средний размер пор - 10-15 мкм), обеспеченную системой подвода вакуума с давлением на входе и выходе 0,015-0,1 МПа, подают в течение 3 минут одноразово 0,5 дм 3 инокулята штамма бактерий .ИМиВ-В-10 (титр - 107 кл/мл) со скоростью 2,2 м 3/м 2 ч. Степень иммобилизации клеток биомассы составляла 68(титр фильтрата - 104 кл/мл). Затем через фильтр установки, обеспеченный терморегулирующим устройством (температура 20 С), пропускали трехразово с той же скоростью имитат осветленной пульпы объемом 1,5 дм 3 (содержание цианидов - 350 мг/дм 3) с рН 8,5. Время полной биодеградации цианидов составляло 15 минут, рН очищенной пульпы - 7,3. При тех же условиях биохимической очистки использовали реальную осветленную пульпу объемом 1,5 дм 3 с рН 9,8 состава, мг/дм 3 2 - 33,75 2 0,88 2 - 0,26 2 - 4,76 2, 3 - 4,96 6 1,26 2 - 1,5 -1 - 105,1. Предварительную иммобилизацию полистирольного биофильтра осуществляли с использованием 0,5 дм 3 инокулята штамма бактерий (3 минуты). Подача пульпы была однократной. Полная очистка от цианидов была достигнута в течение 25 минут. Пример 7, относящийся к очистке пульпы от простых и комплексных цианидов металлов Использовали пульпу (рН 9,8) состава, мг/дм 3 2- 33,75 2 - 0,88 2 - 0,26 2 - 4,76 2,3 - 4,96 6 - 1,26 2 - 1,5 -1 (простые и комплексные) - 105,1. В специальную фильтрующую установку (ворон ка Бюхнера со сменной округлой пластинкой из полистирола, средний размер пор - 10-15 мкм), обеспеченную системой подвода вакуума с давлением на входе и выходе 0,015-0,01 МПа и терморегулирующим устройством, подавали осветленную пульпу при 20 С в количестве 1,5 дм 3 поэтапно (20 раз подряд) в течение 1 часа. Концентрация цианидов не изменилась и составляла 105,1 мг/дм 3. В тех же условиях очистки, однако при температуре 30 С, концентрация цианидов составила 105,0 мг/дм 3. Таким образом, лишь в присутствии инокулята штамма бактерийИМиВ-В-10, предварительно нанесенного на полистирольные фильтрующие элементы с заданными характеристиками,удается полностью разрушить простые и комплексные цианиды металлов (пример 6). В то же время при тех же условиях очистки, но в отсутствии указанной биомассы штамма бактерий, процесс окисления цианидов даже при 30 С, практически не протекает (пример 7). Следовательно, процесс деградации простых и комплексных цианидов пульпы носит биохимический характер. Подтверждением тому являются также примеры 3, 4 и 5 с использованием других средств иммобилизации биомассы бактерий(сорбентов), относительно менее эффективных по сравнению с полистирольными фильтрующими элементами. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерийИМиВ-В-10,разлагающий простые и комплексные цианиды пульпы.