Способ выделения ДНК микобактерий туберкулеза

(51) 61 10/00 (2011.01) 01 33/53 (2011.01) 01 33/48 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам (рифампицин, изониазид) экспрессметодом. Способ выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты микобактерий туберкулеза включает исследование образцов патологического материала,взятых от больного туберкулезом с использованием набора реактивов 1.0,предусматривающее скатывание клеток в шарики для удаления жидких образцов, лизис под воздействием щелочных условий при температуре 95 С в течение 10 минут и нейтрализацию, при этом дополнительно перед этапом нейтрализации осуществляют инкубацию в ультразвуковой бане в течение 10 минут. Предлагаемый способ повышает эффективность выделения ДНК МБТ в среднем в 1,3 раза и соответственно получения положительных результатов лекарственной чувствительности экспресс-методом.(72) Абилдаев Тлеухан Шилдебаевич Чингисова Ляйла Турсунбековна Аленова Арике Хамзовна Бсмлда Венера Лазарьызы(73) Республиканское государственное казенное предприятие Национальный центр проблем туберкулеза Республики Казахстан Министерства здравоохранения Республики Казахстан(56) Инструкция по проведению выделения ДНК МБТ.0 //, 2006, с.27(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА(57) Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии и может быть использовано для выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) микобактерий туберкулеза (МБТ) для дальнейшего определения лекарственной чувствительности Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии и может быть использовано для выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) микобактерий туберкулеза (МБТ) для дальнейшего определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам (рифампицин, изониазид) экспрессметодом. Определение лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза имеет большое значение,так как позволяет выбрать дальнейшую тактику лечения и влияет на исход заболевания. Своевременность выявления мультирезистентности позволит вовремя изолировать таких больных,назначать адекватное лечение, осуществлять качественный эпидемиологический контроль над мультирезистентным туберкулезом среди населения. В свою очередь, своевременная и адекватная химиотерапия больных туберкулезом способствует благоприятному течению и исходу заболевания, снижению резервуара инфекции в обществе,снижению риска инфицирования взрослых и детей. Известен способ выделения ДНК МБТ,включающий исследование образцов патологического материала, взятых от больного туберкулезом, с использованием набора реактивов 1.0, предусматривающее скатывание клеток в шарики для удаления жидких образцов,лизис под воздействием щелочных условий при температуре 95 С в течение 5 минут и нейтрализацию. Способ позволяет выделить бактериальную ДНК МБТ непосредственно из образцов патологического материала, взятых от больных туберкулезом(Инструкция по проведению выделения ДНК МБТ 1.0-.2006.- 27 с.) Недостатком данного способа является то, что процент положительных результатов выделения ДНК МБТ низкий (68,8), следовательно, способ недостаточно эффективен. Задачей изобретения является разработка способа выявления ДНК МБТ, который в отличие от прототипа увеличивает вероятность выделения ДНК МБТ из образцов, взятых непосредственно от больных туберкулезом на 18,7. Техническим результатом изобретения является повышение процента выделения ДНК МБТ и соответственно получения положительных результатов лекарственной чувствительности экспресс-методом за счет дополнительных этапов в процедуре выделения ДНК МБТ. Указанный технический результат достигается тем, что в способе выделения ДНК МБТ,включающем исследование образцов патологического материала, взятых от больного туберкулезом, с использованием набора реактивов 2 1.0, предусматривающее скатывание клеток в шарики для удаления жидких образцов,лизис под воздействием щелочных условий при температуре 95 С и нейтрализацию, отличительной особенностью, согласно изобретению, является то,что лизис под воздействием щелочных условий осуществляют в водяной бане в течение 10 минут и дополнительно перед этапом нейтрализации осуществляют инкубацию в ультразвуковой бане в течение 10 минут. Увеличение времени этапа лизиса в 2 раза и дополнительная инкубация в ультразвуковой бане в течение 10 минут способствуют увеличению процента выделения ДНК МБТ и соответственно получению положительного результата лекарственной чувствительности методом. Способ осуществляется следующим образом Больной туберкулезом легких перед началом химиотерапии после тщательного туалета полости рта отхаркивает мокроту в специальный стерильный контейнер, после чего патологический материал доставляется в бактериологическую лабораторию для выявления лекарственной чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам(рифампицин и изониазид) экспресс-методом. Способ предусматривает возможность исследования и другого патологического материала- бронхоальвеолярных смывов и бронхиальных аспиратов, трахеального секрета, желудочного сока,при туберкулезе мочеполовой системы - мочи,менструальной крови и т.д. Для определения лекарственной чувствительности МБТ к рифампицину и изониазиду методомнеобходимо в первую очередь выделить ДНК МБТ из патологического материала с помощью набора реактивов 1.0. Процедура выделения ДНК МБТ состоит из следующих этапов 1. Перенести 500 мкл деконтаминированной мокроты (или другого патологического материала) в пронумерованную 1,5 мл пробирку с закручивающейся крышкой. Центрифугировать 15 минут при 10000 об/мин в центрифуге с аэрозольнепроницаемым ротором. 2. Удалить супернатант и ресуспензировать осадок в 100 мкл лизирующего буфера (-) в вортексе. 3. Инкубировать образец 10 минут при 95 С в водяной бане. 4. Инкубировать в ультразвуковой бане 10 минут. 5. Добавить 100 мкл нейтрализующего буфера(-) в лизат и поместить образец в вортекс на 5 секунд. 6. Осадить 5 минут на полной скорости центрифуги и использовать 5 мкл супернатанта непосредственно для определения лекарственной чувствительности МБТ к рифампицину и изониазиду. С целью подтверждения эффективности предлагаемого способа в бактериологической референс-лаборатории Национального центра проблем туберкулеза МЗ РК была выделена ДНК микобактерий туберкулеза из мокроты 32 больных с впервые выявленным туберкулезом легких до начала химиотерапии с помощью набора реактивов 1.0 по предлагаемому способу. Параллельно была выделена ДНК МБТ из мокроты тех же больных набором реактивов 1.0 по стандартной методике. Было отмечено, что при выделении ДНК МБТ по усовершенствованной методике на 18,7 чаще были получены положительные результаты исследования (таблица). Таблица Сравнительный анализ положительных результатов выделения ДНК МБТ по прототипу и предлагаемому способу Выделение ДНК 32 Как видно из таблицы, положительные результаты при применении способа аналога получены в 68,8 случаев, при использовании усовершенствованного нами способа положительные результаты получены в 87,5 случаев, что на 18,7 выше. Таким образом,предлагаемый способ выделения ДНК МБТ эффективнее известного в среднем в 1,3 раза. Приводим клинический пример Больной Б., 21 г., уроженец города Алматы,поступил в отделение для лечения впервые выявленного туберкулеза НЦПТ МЗ РК с жалобами на кашель с выделением мокроты в течение 1 месяца, слабость, утомляемость, потливость по ночам, снижение аппетита, снижение веса. Туберкулез выявлен по обращаемости. При появлении выше перечисленных жалоб обратился к участковому терапевту по месту жительства,лечился неспецифическими антибиотиками по поводу острого бронхита, без эффекта. Был направлен на консультацию к фтизиатру в районный противотуберкулезный диспансер,где был установлен диагноз туберкулеза на основании положительного результата бактериоскопии,анамнеза, клинико-рентгенологических данных. В НЦПТ МЗ РК у больного была исследована мокрота на микобактерии туберкулеза методом бактериоскопии, посева на ВАСТЕС, проведено определение лекарственной чувствительности МБТ к рифампицину и изониазиду экспресс-методомнепосредственно из мокроты. При этом для выделения ДНК МБТ из мокроты с помощью реактивов 1.0 были использованы два способа (аналог и предлагаемый),для чего порция полученной мокроты была разделена на 2 равные части с последующим проведением определения лекарственной чувствительности МБТ к двум противотуберкулезным препаратам. При выделении ДНК МБТ по аналогу (1.0) результат был отрицательный, по предлагаемому способу - положительный. Таким образом,предложенный способ выделения ДНК МБТ у больных туберкулезом легких с помощью набора реактивов 1.0 и усовершенствованный путем удлинения этапа инкубации в водяной бане и добавления этапа инкубации в ультразвуковой бане, значительно увеличивает процент выделения (на 18,7) ДНК МБТ и соответственно процент положительных результатов определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам рифампицин и изониазид экспресс-методом. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ выделения ДНК микобактерий туберкулеза, включающий исследование образцов патологического материала, взятых от больного туберкулезом, с использованием набора реактивов 1.0, предусматривающее скатывание клеток в шарики для удаления жидких образцов,лизис под воздействием щелочных условий при температуре 95 С и нейтрализацию,отличающийся тем, что лизис под воздействием щелочных условий осуществляют на водяной бане в течение 10 минут и дополнительно перед этапом нейтрализации осуществляют инкубацию в ультразвуковой бане в течение 10 минут.