Способ выделения микобактерий туберкулеза на плотной питательной среде

(51) 12 1/20 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ использовано для выделения микобактерий туберкулеза (МБТ) на плотной питательной среде. Способ выделения микобактерий на плотной питательной среде Левенштейна-Иенсена,состоящей из раствора минеральных солей, 2 раствора малахитового зеленого,гомогенизированных цельных яиц, в которую непосредственно перед посевом патологического материала в пробирку с плотной питетельной средой Левенштейна-Йенсена добавляют 0,8 мл ростовой добавки , содержащей бычьего альбумина - 50,0 г, декстрозы - 20,0 г, каталазы 0,03 г, олеиновой кислоты - 0,1 г, полиоксиэтилена стеарата - 1,1 г в 1000 мл дистиллированной воды, с последующей инкубацией при температуре 36-37 С. Применение предлагаемого способа ускоряет рост МБТ при посеве патологического материала в 1,5-4 раза.(72) Белова Елена Сергеевна Бисмилда Венера Лазаревна Чингисова Ляйля Турсунбековна(73) Республиканское государственное казенное предприятие Национальный центр проблем туберкулеза Республики Казахстан Министерства здравоохранения Республики Казахстан(56) Агзамова Р.А., Белова Е.С., Бисмилда В.Л и др. Культуральные методы выявления микобактерий туберкулеза и определение лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам 1-й линии. Метод.рекомендации. Алматы, 2004, с. 19-23(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА НА ПЛОТНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии и может быть использовано для выделения микобактерий туберкулеза (МБТ) на плотной питательной среде. Известен способ выделения микобактерий,включающий посев патологического материала на плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена,состоящую из раствора минеральных солей, 2 раствора малахитового зеленого,гомогенизированных цельных яиц, с последующей инкубацией при температуре 36-37 С.(Агзамова Р.А., Белова Е.С., Бисмилда В.Л и др. Культуральные методы выявления микобактерий туберкулеза и определение лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам 1-й линии.-метод.рекомендации.Алматы.-2004.-с. 19-23) Недостатком данного способа является то, что результаты роста МБТ можно оценить не ранее чем через 21-56 дней от момента посева патологического материала. В условиях напряженной эпидемиологической ситуации по туберкулезу и ежегодного увеличения числа лекарственно-устойчивых форм туберкулеза,требующих быстрого внесения изменений в стандартные схемы лечения с учетом лекарственной чувствительности возбудителя, такие длительные сроки роста МБТ могут быть причиной назначения неадекватного лечения больных туберкулезом и, как следствие, приводить к неудачам лечения. В связи с вышесказанным имеется острая необходимость в разработкеновых способов,которые могли бы ускорить получение результатов роста МБТ. Задача изобретения - разработка способа выделения микобактерий туберкулеза на плотной питательной среде, техническим результатом применения которого является ускорение роста МБТ при посеве патологического материала в 1,5 - 4 раза. Указанный технический результат достигается тем, что в способе выделения микобактерий,включающем посев патологического материала на плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена,состоящую из раствора минеральных солей, 2 раствора малахитового зеленого,гомогенизированных цельных яиц, с последующей инкубацией при температуре 36-37 С,отличительной особенностью,согласно изобретению, является то, что непосредственно перед посевом патологического материала в пробирку с плотной питательной средой Левенштейна-Йенсена добавляют 0,8 мл ростовой добавки , содержащей бычьего альбумина 50,0 г, декстрозы - 20,0 г, каталазы - 0,03 г,олеиновой кислоты - 0,1 г, полиоксиэтилена стеарата- 1,1 г в 1000 мл дистиллированной воды. Способ осуществляется следующим образом. Готовят стандартную плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена, для чего в большой стерильной колбе, соблюдая правила асептики,тщательно перемешивают следующие ингредиенты 2 600 мл раствора минеральных солей, содержащего фосфата калия однозамещенного безводного - 2,4 г,сульфата магния - 0,24 г, цитрата магния - 0,6 г, аспарагина - 3,6 г, глицерина чистого - 12 мл, 20 мл 2 раствора малахитового зеленого, 1000 мл гомогенизированных цельных яиц (20-25 штук, в зависимости от размера). Готовую питательную среду переливают в стерильные пробирки по 6-8 мл среды в каждую, помещают в аппарат для свертывания среды не позже, чем через 15 минут. Оставляют в аппарате на 45 минут при температуре 80-85 С. Непосредственно перед посевом патологического материала добавляют 0,8 мл ростовой добавки , содержащей бычьего альбумина - 50,0 г, декстрозы - 20,0 г, каталазы 0,03 г, олеиновой кислоты - 0,1 г, полиоксиэтилена стеарата - 1,1 г в 1000 мл дистиллированной воды. После чего осуществляют посев патологического материала (мокроты) от больного туберкулезом. Для посева используют бактериологическую петлю(металлическую или одноразовую) или пастеровскую пипетку, в зависимости от вида патологического материала. После предварительной обработки исследуемого материала на каждый косяк питательной среды наносят 0,2-0,3 мл (либо 2-3 капли или 2-3 бактериологические петли) осадка,полученного после центрифугирования мокроты, и распределяют материал по поверхности. Инкубируют посевы до появления роста при температуре 36-37 С. Учет результатов ведут ежедневно, до появления шероховатых, сморщенных восковидных колоний кремоватого цвета,типичных для МБТ. Интенсивность роста оценивают по 4-х балльной системе- единичные колонии, до 20 (скудное бактериовыделение)- от 20 до 100 колоний (умеренное бактериовыделение)- более 100 (массивное бактериовыделение)- сплошной рост колоний (массивное бактериовыделение) Для подтверждения эффективности предлагаемого способа и изучения влияния ростовой добавкина рост культуры МБТ в бактериологической референс лаборатории Национального центра проблем туберкулеза МЗ РК были выполнены 2 серии наблюдений. В первой (контрольной) серии мокроту в количестве 5 проб, полученную от больных туберкулезом с подтвержденным бактериовыделением,засевали на среду Левенштейна-Йенсена по способу аналогу. Во второй серии экспериментов во все 5 пробирок со средой Левенштейна-Йенсена в стерильных условиях добавляли ростовую добавкув количестве 0,8 мл. После этого засевали в пробирки мокроту от тех же больных. Все пробы ставили в термостат при температуре 37 С на инкубацию. Учет результатов проводили ежедневно до получения роста. Результаты представлены в таблицах 1 и 2. Таблица 1 Сроки и интенсивность роста МБТ на среде Левенштейна-Йенсена Сроки начала роста культуры образца 14 день 20 день 26 день 32 день 38 день 44 день 50 день 56 день 1 2 3 4 5 Средний срок появления роста Таблица 2 Сроки и интенсивность роста МБТ на среде Левенштейна-Йенсена с ростовой добавкой Сроки начала роста культуры образца 14 день 16 день 26 день 32 день 38 день 44 день 50 день 56 день 1 2 3 4 5 Из данных таблицы 1 видно, что при посеве патологического материала по способу аналогу первый рост МБТ был зарегистрирован на 20 день наблюдения (проба 1), в остальных пробах появление роста было отмечено в сроки от 26 дня(проба 4) до 56 дней (проба 3). При расчете показателей оказалось, что в этой группе средние сроки появления роста МБТ из патологического материала составили 3311,9 дней. Из таблицы 2 видно, что при посеве патологического материала по предлагаемому способу на среде Левенштейна-Йенсена с ростовой добавкой , рост МБТ в 4 из 5 проб появился уже на 14 день наблюдения, и только в одной пробе на 16 день. Средние сроки появления роста МБТ из патологического материала в этой группе наблюдения составили 14,40,8 дней. Таким образом, рост МБТ из патологического материала в опытной группе начался в 2,3 раза раньше, чем в контрольной на стандартной среде. Средний срок появления роста ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ выделения микобактерий, включающий посев патологического материала на плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена,состоящую из раствора минеральных солей,2 раствора малахитового зеленого,гомогенизированных цельных яиц, с последующей инкубацией при температуре 36-37 С,отличающийся тем, что непосредственно перед посевом патологического материала в пробирку с плотной питательной средой Левенштейна-Йенсена добавляют 0,8 мл ростовой добавки ,содержащей бычьего альбумина - 50,0 г, декстрозы 20,0 г, каталазы - 0,03 г, олеиновой кислоты - 0,1 г,полиоксиэтилена стеарата-1,1 г в 1000 мл дистиллированной воды.