Способ получения антигена вируса болезни Ауески для серологических реакций

(51) 12 7/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ с последующей очисткой и концентрированием вируссодержащего материала который предусматривает- сбор вируссодержащего материала методом замораживание-оттаивание через 36-48 часов после инфицирования, однократное замораживание при температуре минус 40 С и оттаивание при 2022 С.- осветление вируссодержащей суспензии центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин,температура рефрижератора 4 С.- добавление в полученную суспензию ПЭГ-6000 до конечной концентрации 6 идо конечной концентрации 3, после полного растворения проводилось осаждение в течение ночи при 4 С.- осаждение полученного преципитата центрифугированием при 3000 об/мин, в течение 30 минут при температуре рефрижератора 4 С и осадок ресуспендируют в 0,05 М ФБР с рН 7,2.- центрифугирование через 30 сахарозу при 25000 об/мин, в течение 1,5 час при температуре рефрижератора 4 С. Собирали осадок, подвергали ресуспендированию в 0,05 М ФБР с рН 7,2.(72) Абдрахманов Сарсенбай Кадырович Есенеева Салтанат Советовна Асауова Женисгуль Сейткалиевна Секенова Алия Ержановна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет имени Сакена Сейфуллина(56) Вопросы вирусологии 3. Всероссийский НИИ защиты животных, г. Владимир, 1995 г, с. 128-230(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА БОЛЕЗНИ АУЕСКИ ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ(57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к получению высокоочищенного антигена для приготовления диагностикумов, с применением штамма УБ-95 болезни Ауески. Технической задачей изобретения является получение вируссодержащего сырья с высокой цитопатической активностью (до 9,0 1 ТЦД 50/см 3) с использованием штамма УБ-95 болезни Ауески 22182 Изобретение относится к ветеринарной вирусологии,в частности к получению высокоочищенных концентрированных вирусных препаратов для изучения иммунобио-логических свойств и получению высокоактивных диагностических препаратов вируса болезни Ауески, с применением штамма УБ-95 болезни Ауески. Известен способ получения очищенного вируса с использованием вируса болезни Ауески штамма УНИИЭВ-18 вс 1-го пассажа, выращенный в суспензионной культуре клеток ВНК-21. Культуральную жидкость содержащую вирус болезни Ауески осветляли центрифугированием при 3000 в течение 20 мин. На следующий стадии очистки вирус концентрировали преципитацией полиэтиленгликолем /ПЭГ/. Для этого в очищенный супернатант вносили хлорид натрия в конечной концентрации 0,5 М, тщательно перемешивали и добавляли ПЭГ -115 в виде стерильного раствора до конечной концентрации 8-10 . рН вируссодержащей суспензии поддерживали в диапазоне 7,2-7,45 М раствором аммиака или 5 М гликолевым буфером. Для формирования осадка материал инкубировали в течение 18-20 часов при 4 С. Полученный преципитат осаждали центрифугированием при 3000 в течение 20 мин. Осадок ресуспендировали в растворе Хенкса, рН 7,2-7,4 в 1/100 от начального объема и затем осветляли его центрифугированием при 10000 в течение 15 мин. Концентрированный 100 раз вирус имел титр инфекционности 9,50,2 1 ТЦД 50/мл (исходный вирус имел титр 8,00,1 1 ТЦД 50/мл) и комплементсвязывающую активность 1256. Полученный 100 кратный концентрат очищали с помощью зонального центрифугирования в самоустанавливающемся градиенте плотности сахароза при 98000 в течение 6 часов (Вопросы вирусологии 3, Всероссийский НИИ защиты животных, г. Владимир -1995 г, с.128-230). Недостатками аналога является трудоемкость процесса очищения и применяемые химические вещества для очистки безоболочечных вирусов,непригодно, так как вирус болезни Ауески имеет липидную оболочку клеточного происхождения. Технической задачей изобретения является получение вируссодержащего сырья с применением схемы очистки и концентрирования для получения антигена позволяющего выявлять наличие антител к вирусу болезни Ауески. Антиген получают следующим образом. Использовали вирус болезни Ауески штамм УБ-95, выращенный в суспензионной культуре клеток ВНК-21 с посевной концентрацией 2,5 х 106 млн/мл. Сбор вируссодержащего материала проводили замораживанием-оттаиванием через 36-48 часов после инфицирования, однократное замораживание при температуре минус 40 С и оттаивание при 2022 С, осветляли центрифугированием вируссодержащей суспензии при 3000 об/мин в течение 30 мин, температура рефрижератора 4 С. К полученной суспензии добавляли ПЭГ-6000 до 2 конечной концентрации 6 идо конечной концентрации 3. После полного растворения проводилось осаждение в течение ночи при 4 С. Преципитат осаждали центрифугированием при 3000 об/мин, в течение 30 минут при температуре рефрижератора 4 С и осадок ресуспендируют в 0,05 М ФБР с рН 7,2,Полученную взвесь подвергали центрифугированию через 30 сахарозу при 25000 об/мин,в течение 1,5 час при температуре рефрижератора 4 С. Собирали осадок, подвергали ресуспендированию в 0,05 М ФБР с рН 7,2. Данный способ культивирования штамма УБ-95 и очистка вируссодержащего материала, обеспечивает получение концентрированного антигена, очищенный на 99,98 пригодного для использования в дальнейших экспериментах. Удельная инфекционность препарата после очистки составила 10-15. Морфологические свойства. Вирус болезни Ауески относится к семействуподсемействарод пайкиловирус. Возбудитель-- 1 имеет один серотип, несмотря на большие вариации вирулентности и тропизма разных штаммов. Геном вируса состоит из линейной двунитчатой ДНК с молекулярной массой 92-102 кД. Вирион состоит из капсида диаметром 120-150 нм, окруженного содержащей липиды оболочкой. Плавучая плотность вирионов в градиенте хлористого цезия 1,27-1,29 г/см. Капсид имеет икосаэдрическую форму, содержит 162 частично полых капсомера. Капсид окружает ядро вириона, состоящее из ДНК,покрытой белком. В составе вириона определено до 32 белков с молекулярной массой до 290 кД. Вирионы имеют сложную организацию, включая не менее 4 компонентов , капсид, суперкапсидную структуру и оболочку. Культуральные свойства. Биологическая активность вакцинного штамма УБ-95 вируса болезни Ауески составляет 7,5 1 ТЦД 50/см 3. Сбор вируса проводят замораживаниемоттаиванием через 36-48 часов после инфицирования. Антигенные свойства. При введении антигена штамма вируса УБ-95 в организм животных вызывает образование вируснейтрализующих,комплементсвязывающих и преципитирующих антител. Сохраняемость. Вакцинный штамм УБ-95 вируса болезни Ауески, хранят в лиофилизированном состоянии при минус 20 С со стабилизирующей средой пептон и лактоза 3 и 2 соответственно. Пример 1. Инфицируют вирусом болезни Ауески штамм УБ-95, сбор вируса проводят замораживанием-оттаиванием через 36-48 часов после инфицирования, однократное замораживание при температуре минус 40 С и оттаивание при 20-22 С. Осветление вируссодержащей суспензии проводят при 3000 об/мин в течение 30 мин. В качестве антигена использовали надосадок. Пример 2. Инфицируют вирусом болезни Ауески штамм УБ-95. Сбор вируса проводят 22182 замораживанием-оттаиванием через 48 часов после инфицирования, однократное замораживание при температуре минус 40 С и оттаивание при 2022 С. Проводят осветление вируссодержащей суспензии при 3000 об/мин в течение 30 мин. Температура рефрижератора 4 С, в дальнейшем к суспензии добавляем ПЭГ-6000 до конечной концентрации (6) идо конечной концентрации 3. После полного растворения проводилось осаждение в течение ночи при 4 С. Пример 3. Инфицируют вирусом болезни Ауески штамм УБ-95, через 24-36 часов после образования монослоя в дозе 0,01-0,1 ТЦД 50/кл,вносят вирус в сосуды вместе с поддерживающей средой ПСП с 5 прогретой сыворотки КРС(30030 мл). Сбор вируса проводят замораживаниемоттаиванием через 36-48 часов после инфицирования, однократное замораживание при температуре минус 40 С и оттаивание при 20-22 С Осветление вируссодержащей суспензии при 3000 об/мин, в течение 30 мин. Температура рефрижератора 4 С. Добавляем к суспензии ПЭГ 6000 до конечной концентрации (6) идо конечной концентрации 3. После полного растворения проводили осаждение в течение ночи при 4 С. В дальнейшем проводили центрифугирование при 3000 об/мин в течение 30 минут при температуре рефрижератора 4 С и осадок ресуспендировали в 0,05 М ФБР с рН 7,2. Полученную взвесь подвергали центрифугированию через 30 сахарозу при 25000 об/мин,в течение 1,5 час при температуре рефрижератора 4 С. Собирают осадок, подвергают ресуспендированию в 0,05 М ФБР с рН 7,2. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена для серологических реакции болезни Ауески, включающий очистку и концентрирование вируса, отличающийся тем, что используют вирус болезни Ауески штамма УБ-95,сбор вируссодержащего материала проводят замораживанием-оттаиванием через 36-48 часов после инфицирования, однократное замораживание при температуре минус 40 С и оттаивание при 2022 С, подвергают осветлению вируссодержащей суспензии центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин, температура рефрижератора 4 С,добавляют в полученную суспензию ПЭГ-6000 до конечной концентрации 6 идо конечной концентрации 3, после полного растворения проводилось осаждение в течение ночи при 4 С,осаждают полученный преципитат центрифугированием при 3000 об/мин, в течение 30 минут,при температуре рефрижератора 4 С и осадок ресуспендируют в 0,05 М ФБР с рН 7,2, в дальнейшем проводят центрифугирование через 30 сахарозу при 25000 об/мин, в течение 1,5 часа при температуре рефрижератора 4 С, собирают осадок и подвергают ресуспендированию в 0,05 М ФБР с рН 7,2.