Способ получения антигена вируса классической чумы свиней для серологических реакций

(51) 12 7/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ 3,75-4,5 ИД 50/см 3 штамма вируса классической чумы свинейс последующей очисткой и концентрированием вируссодержащего материала,который предусматривает гомогенизацию вируссодержащего материала в буфере, осветление гомогената при 2000 об/мин 30 минут на рефрижераторной центрифуге, в вируссодержащую жидкость после осветления добавляют полиэтиленгликоль 6000 до конечной концентрации 6, перемешивают до полного растворения, затем суспензию оставляют на ночь при 4 С, на следующий день центрифугируют при 5000 об/мин 30 мин, полученный осадок в дальнейшем подвергают центрифугированию при 35000 об/мин в течение 2 часов, полученный осадок ресуспендируют в-буфере и наслаивают на 20-4060 сахарозу, центрифугируют при 25000 об/мин в течение 4 час. Данный способ позволяет провести 99,99 очистку и концентрирование вируса классической чумы свиней.(72) Абдрахманов Сарсенбай Кадырович Есенеева Салтанат Советовна Асауова Женисгуль Сейткалиевна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет имени Сакена Сейфуллина(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности получению очищенного антигена вируса классической чумы свинейштамма КТ. Технической задачей изобретения является получение активного вирус содержащего сырья с биологической активностью в готовом продукте 22183 Изобретение относится к ветеринарной вирусологии в частности к способу получения антигена для изготовления диагностических препаратов и может найти применение в ветеринарнойпрактике для диагностики и выявления антител в сыворотке крови вакцинированных,переболевших или подозреваемых в переболевании классической чумой свиней. Известен способ получения очищенного вируса классической чумы свиней (КЧС), необходимого для выделения вирионной РНК и полипептидов, а также для иммунизации животных с целью получения специфических сывороток и моноклональных антител для диагностики КЧС. В качестве исходной вируссодержащей жидкости использовали инфицированные штаммами ШиМынь и клонированным вариантом вакцинного штамма ЛК-ВНИИВВиМ культуры клеток РК-15 и ПСГК с титром инфицированности не ниже 6,01 БОЕ 50/мл. Схема очистки включает экстракцию вируса из инфицированных клеток гомогенизацией с фреоном -113, дифференциальное центрифугирование вне и внутриклеточного вируса с последующим центрифугированием в градиенте плотности глицерин/К, -тартрат. (Перзашкевич, Кадетов В.В., Цыбанов С.Ж., Куринов В.В.,Балышева В.И. Очистка вируса классической чумы свиней Сборник научно-практической конференции. Актуальные проблемы ветеринарной вирусологии, г. Покров, 1994 г. с.20-21). Недостатками аналога являются дороговизна используемых реактивов, сравнительно низкий выход по инфекционности 5,0-10,0, низкий процент белка по очистке 99,64. Известен лапинизированный штамм К вируса классической чумы свиней (Ю.Ф. Борисович Ветеринарные препараты. М. Колос, 1981. с.101102), используемый в РФ для производства вирусвакцины против данной инфекции,биологическая активность которого составляет 2,53,5 ИД 50/2 см 3. Сбор вируссодержащего материала начинают через 48 часов после инфицирования кроликов (срок наблюдения температурной реакции) и длится до 120 часов,схема очистки вирусного материала неизвестен. Недостатками аналога являются сравнительно низкая биологическая активность и большие сроки сбора вирусного материала и без схемы очистки. Технической задачей изобретения является разработка способа получения стабильного антигена с оптимальной схемой очистки вирусного материала, позволяющего выявить наличие антител к вирусу классической чумы свиней и обладающего достаточной активностью и специфичностью. Антиген получают следующим образом. В работе использовали лапинизированный штамм КТ при внутривенном заражений здоровых кроликов живой массой 2-3 кг матриксным вирусом в разведении 110 в объеме 1 см 3 с ежедневным измерением температуры у зараженных кроликов. Через 48-72 часов проводили сбор вирусного материала. Биологическая 2 активность штамма соответствует 3,75-4,5 ИД 50/см 3. Для изготовления антигена применяли схему очистки и концентрирование вируссодержащего материала который предусматривает следующие этапы работ 1. Гомогенизация вируссодержащего материала в-буфере (0,1 М трис НС 1, рН 7.4, 0,1 М 10-4 ЭДТА) 2. Осветление гомогената при 2000 об/мин 30 минут (на рефрижераторной центрифуге). 3. Осаждение ПЭГ-6000 в вируссодержащую жидкость (после осветления) добавляли полиэтиленгликоль 6000 до конечной концентрации 6. Перемешивали до полного растворения, затем суспензию оставляли на ночь при 4 С. На следующий день центрифугировали при 5000 об/мин 30 мин. Для дальнейших экспериментов использовали осадок 4. Ультряцентрифугирование Полученный осадок в дальнейшем подвергали центрифугированию при 35000 об/мин в течение 2 час. 5. Градиентное центрифугирование через слой 2060 сахарозы. Полученный ультрацентрифугированием осадок ресуспендировали в- буфере и наслаивали на 20-40-60 сахарозу. Центрифугировали при 25000 об/мин в течение 4 час. Очистка и концентрирование вируса по вышеописанной схеме позволили получить препарат, концентрированный в 500-1000 раз,очищенный от сопутствующих белковых веществ на 99,99. Удельная инфекционность препарата после очистки составила 20-25. Полученную таким образом антиген расфасовывали в пробирки Эппен-дорф по 20 мкл и хранили при -70 С. Морфологические свойства. Согласно современной классификации вирус классической чумы свиней, наряду с вирусами пограничной болезни овец и вирусной диареи КРС, относится к роду, семейства . Геном пестивирусов представляет собой однонитевую РНК положительной полярности размером около 12,3 тыс. нуклеотидов. Единственная длинная открытая трансляционная фаза в геноме пестивирусов кодирует полипротеин,состоящий из приблизительно 4000 аминокислот,который подвергается протеолитическому расщеплению в процессе трансляции и посттрансляционно. В результате белокпредшественник расщепляется на зрелые структурные и неструктурные белки. Первый белок представляет собой собственную протеазу, не входящую в структуру вириона. За ней следует структурный белок С и З ассоциированных с мембраной поверхностных гликопротеина Е 0, ,2. Остальная часть генома кодирует неструктурные белки, включая вирусную РНК-полимеразу. Культуральные свойства. Биологическая активность лапинизированного штамма КТ вируса классической чумы свиней, составляет 2,53,5 ИД 50/2 см 3. Сбор вируссодержащего материала для наработки антигена начинают через 48 часов после инфицирования кроликов (срок 22183 наблюдения температурной реакции) и длится до 72 часов. Антигенные свойства. При введении антигена штамма вируса КТ в организм животных (белые мыши, морские свинки, свиньи) вызывает образование вируснейтрализующих,комплементсвязывающих и преципитирующих антител. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма КТ вируса классической чумы свиней при пассировании через организм кроликов, сохраняются в течение 12 пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Сухую вирусвакцину штамма КТ вируса классической чумы свиней, хранят в сухом темном месте при температуре до 6 С. Допускается хранение при любых минусовых температурах. Срок годности вирусвакцины 12 месяцев со дня изготовления. Антиген получают следующим образом. Пример 1. Для наработки вирусного материала отбирают клинически здоровых кроликов породы шиншилла живой массой 2,5-3 кг. Внутривенно вводят вируссодержащий материал штамма вируса классической чумы свинейКТ в объеме 1 см 3 с известной биологической активностью. Через 36-48 часов проводят сбор вирусного материала. Очистку вируссодержащего материала производят ультрацентрифугированием при 35000 об/мин в течение 2 час. Пример 2. Для наработки вирусного материала отбирают клинически здоровых кроликов породы шиншилла живой массой 2,5-3 кг. Внутривенно вводят вируссодержащий материал штамма вируса классической чумы свинейКТ в объеме 1 см 3 с известной биологической активностью. Через 48-120 часа проводят сбор вирусного материала. Очистку вируссодержащего материала производят гомогенизации вируссодержащего материала в -буфере (0,1 М трис НС 1, рН 7.4, 0,1 Ми 10-4 ЭДТА) Осветление гомогената при 2000 об/мин 30 минут на рефрижераторной центрифуге, в вируссодержащую жидкость после осветления добавляют полиэтиленгликоль 6000 до конечной концентрации 6. Пример 3. Для наработки вирусного материала отбирают клинически здоровых кроликов породы шиншилла живой массой 2,5-3 кг. Внутривенно вводят вируссодержащий материал штамма вируса классической чумы свинейв объеме 1 см 3 с известной биологической активностью. Через 48-72 часов проводят сбор вирусного материала. Схема очистки и концентрирование вируссодержащего материала предусматривает следующие этапы работ Гомогенизация вируссодержащего материала в -буфере (0,1 М трис НС 1, рН 7.4, 0,1 Ми 10-4 ЭДТА) Осветление гомогената при 2000 об/мин 30 минут на рефрижераторной центрифуге Осаждение ПЭГ-6000 в вируссодержащую жидкость после осветления добавляли полиэтиленгликоль 6000 до конечной концентрации 6. Перемешивали до полного растворения, затем суспензию оставляли на ночь при 4 С. На следующий день центрифугировали при 5000 об/мин 30 мин. Полученный осадок в дальнейшем подвергали центрифугированию при 35000 об/мин в течение 2 час. Полученный ультрацентрифугированием осадок ресуспендировали в-буфере и наслаивали на 20-40-60 сахарозу. Цен-трифугировали при 25000 об/мин в течение 4 час. Данный способ позволяет провести 99,99 очистку и концентрирование вируса классической чумы свиней. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена вируса классической чумы свиней для серологических реакций,включающий лапинизированный штамм КТ,отличающийся тем, что полученный вируссодержащий материал подвергают гомогенизации в-буфере, осветление гомогената при 2000 об/мин 30 минут на рефрижераторной центрифуге, в вируссодержащую жидкость после осветления добавляют полиэтиленгликоль 6000 до конечной концентрации 6 , перемешивают до полного растворения, затем суспензию оставляют на ночь при 4 С, на следующий день центрифугируют при 5000 об/мин 30 мин, полученный остаток в дальнейшем подвергают центрифугированию при 35000 об/мин в течение 2 час, полученный осадок ресуспендируют в -буфере и наслаивают на 2040-60 сахарозу, центрифугируют при 25000 об/мин в течение 4 часов.