Штамм F3 гриба Fusarium graminearum для клеточной селекции пшеницы на устойчивость к фузариозной корневой гнили

(51) 12 1/77 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ пшеницы, устойчивых к фузариозной корневой гнили методом клеточной селекции. Технической задачей изобретения - являлось выделение из пораженных тканей растений пшеницы,произрастающих в данном регионе штамма 3 фитопатогенного гриба,обладающего стабильными культурально-морфологическими признаками, высокой токсичностью и патогенностью, а также получение культурального фильтрата гриба, который содержит токсичные метаболиты для использования в клеточной селекции пшеницы. Учитывая актуальность проблемы получения устойчивых к фузариозной корневой гнили новых форм пшеницы, выделен штамм 3 гриба, который обладает стабильными морфолого-культуральными признаками, является высоко токсигенным и патогенным. Культуральный фильтрат штамма 3 грибарекомендуется использовать в клеточной селекции пшеницы в качестве селективного агента штамм 3 гриба. Данный штамм не является производственным штаммом.(72) Муканов Касым Касенович Раманкулов Ерлан Мирхайдарович Саданов Аманкелди Курбанович Сейтбатталова Айнур Исламовна Созинова Любовь Феодосьевна Турганбаева Асия Каирбековна Хапилина Оксана Николаевна Шек Галина Оразтаевна(73) Республиканское государственное казенное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Предварительный патент РК 18918, кл. 12 1/14, 12 1/77, 2007(54) ШТАММ ГРИБА 3 ДЛЯ КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ ПШЕНИЦЫ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ФУЗАРИОЗНОЙ КОРНЕВОЙ ГНИЛИ(57) Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности представляет из себя штамм 3 гриба, который рекомендуется использовать для получения новых ценных форм 22185 Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии,в частности,является фитопатогенным и токсигенным штаммом для получения новых ценных форм пшеницы,устойчивых к фузариозной корневой гнили. Изобретение представляет собой штамм 3 гриба, который рекомендуется использовать в процессе клеточной селекции мягкой пшеницы на устойчивость к фузариозной корневой гнили. Аналог изобретения. Аналогом предлагаемого изобретения является высокопатогенный и токсигенный штамм 1 гриба(предварительный патент РК 53215.2007 г. Штамм 1 грибадля клеточной селекции картофеля на устойчивость к фузариозной сухой гнили). Отличие нашего штамма от аналога заключается в том, что он выделен не из пораженного картофеля, а из пораженных растений яровой мягкой пшеницы. Кроме того, штамм 1 вызывает заболевание картофеля сухой фузариозной гнилью, а штамм 3 является вирулентным по отношению к мягкой пшенице и вызывает заболевание у пшеницы - фузариозную корневую гниль. Задача изобретения - выделить возбудителя фузариозной корневой гнили -из пораженных тканей растений яровой мягкой пшеницы произрастающих в Северном Казахстане,идентифицировать его, изучить морфологические особенности, получить культуральный фильтрат штамма 3 гриба, на основе которых он был использован в качестве селективного агента при проведении клеточной селекции каллусных тканей пшеницы на устойчивость к фузариозной корневой гнили. Выделенный нами штамм предлагается использовать в качестве типового штамма для проведения клеточной селекции - штамм 3 гриба. Типовой штамм 3 обладает стабильными культурально-морфологическими признаками,высокой фитотоксичностью,независимо от углеродного и азотного питания,продолжительности культивирования при положительных температурах, а также высокой ферментативной активностью, фитопатогенностью и позволяет получить культуральный фильтрат,содержащий физиологически активные вещества для использования его в клеточной селекции в отношении яровой мягкой пшеницы на устойчивость к фузариозной корневой гнили. Технический результат, который может быть достигнут при использовании штамма 3 ускоренный отбор сортов мягкой пшеницы,обладающих устойчивостью к корневой фузариозной гнили. Прогрессивным направлением в клеточной селекции на сегодняшний день является отбор ценных исходных форм с использованием селективных факторов,продуцируемых микроскопическими грибами метаболитов патогенов. В клеточной селекции с применением культивирования изолированных клеток пшеницы в искусственных условиях можно успешно 2 использовать культуральный фильтрат штамм 3 фитопатогенного гриба. Такой подход позволяет отобрать в селективных условиях устойчивые каллусные линии,регенерировать из них растения с признаками устойчивости к фузариозной корневой гнили, что весьма актуально и перспективно в плане создания фузариозоустойчивого селекционного материала пшеницы. Достижения технического результата позволит проводить ускоренную оценку сортов мягкой пшеницы в селекционном процессе,семеноводческом процессе. Фузариозная корневая гниль очень распространенная болезнь пшеницы, вызываемая фитопатогенными грибами из рода . Болезнь, развиваясь на ослабленных растениях,поражает корни, узлы кущения и основания стеблей. Пораженные части растений буреют, разрушаются,иногда с образованием сухой гнили. Одновременно с поражением корней распространение гриба по сосудистой системе может привести растение к увяданию. Обычно этот симптом легко распознается по потемнению сосудистого кольца на срезе стебля. На, пораженных грибами листьях, стеблях и других органах растений возникают различного цвета налеты. В последнее время возможность индуцирования иммунитета растений к определенным типам возбудителей активно используется при проведении селекционных работ,в том числе и с применением биотехнологических методов, таких как клеточная селекция. Учитывая актуальность проблемы получения устойчивых к фузариозной корневой гнили новых форм пшеницы, выделен штамм 3 гриба, который обладает стабильными культурально-морфологическими признаками,является высоко токсигенным и патогенным. Культуральный фильтрат штамма 3 гриба рекомендуется использовать в клеточной селекции пшеницы в качестве селективного агента. Штамм 3 грибане является производственным штаммом. Идентификацию грибапроводили на основании культуральных,морфологических признаков, макроскопические особенности штамма гриба изучали на жидкой питательной среде Чапека, микроморфологические методами световой микроскопии. Для получения данного штамма были изучены изоляты грибов из рода,выделенных из пораженных тканей пшеницы различных сортов. Отобранный штамм 3 грибабыл выделен из пораженных тканей пшеницы сорта Акмола 2, выращенного в условиях Акмолинской области. Пример 1. Морфолого-культуральные свойства штамма. На агаризованной среде Чапека формируется распростертая колония. Цвет конидиального газона меняется от белого до розового цвета. Обратная сторона колонии оранжево-розовая. Макроконидии серповидные, 22185 веретеновидные, с 3-5 перегородками, иногда встречались конидии с 7 перегородками,микроконидии удлиненно-овальной формы, с 0-1 перегородками (фиг.1). Для накопления токсических веществ в культуральной жидкости использовали жидкую среду Чапека, с различными источниками углерода сахарозы, глюкозы, мальтозы, лактозы, крахмала,глицерина, которые добавляли в количестве,эквивалентном содержанию 30 г/л сахарозы. Показано, что один и тот же штамм 3 грибаимеет различные морфологокультуральные признаки, в зависимости от источников углерода в среде (таб.1) Так, в вариантах,среды образуются колонии и культуральные жидкости, различающиеся между собой. Активную усвояемость углерода грибом наблюдали на минеральной среде Чапека с лактозой и глицерином. При выращивании штамма 3 грибана среде Чапека с глюкозой,среда оставалась в основном прозрачной, на другом варианте наблюдали помутнение среды. Отсюда следует, что гриб хорошо усваивает лактозу,глицерин, сахарозу, мальтозу и крахмал, хуже глюкозу. Таблица 1 Морфолого-культуральные признаки штамма 3 грибана средах с различными источниками углеродап/п 1 Источник углерода среде Чапека Сахароза Мицелиальная пленка (МП) кремового цвета, культуральная жидкость салатового цвета. Мицелиальная пленка бесцветная, прозрачная, культуральная жидкость светло-серого цвета. Мицелиальная пленка светло-желтого цвета, культуральная жидкость бело-молочная. Мицелиальная пленка белая с кремовым оттенком, культуральная жидкость светло-желтая. Мицелиальная пленка бело-кремовая, культуральная жидкость светло-желтая. Мицелиальная пленка белая с оттенком сиреневого цвета,культуральная жидкость серого цвета, мутная. Пример 2. Фитотоксичность и фитопатогенность штамма 3. Определяли фитотоксичность выделенного штамма методом биопроб на проростках пшеницы. Семена проращивали в растворах токсичного культурального фильтрата. При изучении длины ростков и корешков, массы ростков и корешков растений на каждом варианте опыта установили, что культуральные фильтраты, полученные на среде с крахмалом и сахарозой, стимулируют рост растений, а среда Чапека с глюкозой обладает токсическими свойствами (таб.2). Таблица 2 Влияние источников углерода на фитотоксичность культуральных фильтратов штамма 3 гриба Источник углерода Контроль Глюкоза Мальтоза Лактоза Глицерин Крахмал Сахароза Для опредеения фитопатогенных свойств грибавыращивали различные культуры в почве, инокулированной мицелием. Определяли всхожесть, Токсичность,0 100 87,10 41,57 80,58 89,28 79,28 взвешивали массу ростков и корешков проростков,измеряли длину корней, а также патогенность штамма 3 гриба(таблица 3). 22185 Таблица 3 Фитопатогенность штамма 3 грибана различных сельскохозяйственных культурах Вариант опыта Мягкая пшеница (контроль) Мягкая пшеница (инокулюм) Твердая пшеница (контроль) Твердая пшеница (инокулюм) Ячмень (контроль) Ячмень (инокулюм) Овес (контроль) Овес (инокулюм) Чечевица (контроль) Чечевица (инокулюм) Кукуруза (контроль) Кукуруза (инокулюм) На всех варинтах опыта всхожесть семян на контроле превышала всхожесть семян в вариантах с инокулированной мицелием почве. Самая низкая всхожесть семян (по сравнению с контрольным вариантом) была на варианте с мягкой пшеницей она составила - 54,4. Также значительное снижение всхожести было на вариантах с ячменем 66,6 и овсом - 65,2. Повреждение корневыми гнилями значительно снижают всхожесть семян и селекция устойчивых форм пшеницы к этому заболеванию актуальна. По длине корня (в процентах от контроля) можно судить о патогенности изучаемого штамма а также об устойчивости культуры к нему. Наименьшую длину корня имели мягкая пшеница и кукуруза,следовательно они сильно угнетаются этим штаммом по сравнению с другими культурами. Хотя всхожесть семян кукурузы по сравнению с пшеницей угнетается не значительно, но в процессе роста кукуруза оказалась очень чувствительной к наличию инокулюма грибов,что привело к задержке роста корней, т. е. гриб вызывает снижение всхожести, массы проростков, длину первичных корней важнейших сельскохозяйственных культур. Штамм 3 обладает более патогенными свойствами по отношению к яровой мягкой пшенице. Относится к факультативным паразитам и не является патогенным для человека и животных. Пример 3. Влияние культурального фильтрата штамма 3 грибана каллусные ткани пшеницы. В качестве исходного материала использовали сорта и гибриды яровой мягкой пшеницы Акмола 2 Акмола 40 Астана Сибирская 59 Лютесценс 337/92 Лютесценс 503 Лютесценс 118/95-1 Лютесценс 232/89-1 Лютесценс 305/89-1 Лютесценс 101/94 Лютесценс 49/94-2. Для каллусообразования использовали среду Мурасиге и Скуга, а также среду Мурасиге и Скуга с добавлением культурального фильтрата грибав концентрации 10,20, 30, 50, 70. Изучали два типа эксплантов 4 зрелые и незрелые зародыши семян яровой мягкой пшеницы. Использовали вычленение эксплантов пшеницы на среду с культуральным фильтратом штамма 3 гриба, для получения морфогенной каллусной ткани. В данном случае формирование каллусной ткани происходит сразу в селективных условиях, токсичные метаболиты штамма 3 воздействуют на все этапы жизненного цикла клетки. Показано, что повышение концентрации фильтрата в среде приводит к снижению частоты каллусообразования, снижению массы каллусов в зависимости от концентрации фильтрата в среде (фиг. 2). Сравнив полученные данные можно отметить,что при однократной селекции, культуральный фильтрат штамма 3 грибавызывает изменение роста каллусных тканей некроз, потерю морфогенности, ризогенез. Это позволяет проводить отбор устойчивости к токсичным метаболитам гриба каллусных тканей пшеницы. В то же время, на каждом варианте опыта имеется возможность отобрать устойчивые каллусные линии, из которых в последующем регенерируют растения с признаками устойчивости к возбудителю фузариозной корневой гнили. Пример 4. Проверка эффективности воздействия культурального фильтрата 3 на каллусы при получении устойчивых к фузариозной корневой гнили форм пшеницы. При изучении устойчивости растений-регенерантов были заложен инфекционный фон для тестирования пятого поколения растений-регенерантов на устойчивость к возбудителю корневой гнили пшеницыгрибу(штамм 3). При создании инфекционного фона использовали споровую суспензию (фиг.3). Все семена замачивали в споровой суспензии грибов, затем высевали в полевых условиях рядками длиной по 1 м (фиг.4). После уборки урожая определяли степень поражения растений корневыми 22185 гнилями, продуктивность растений, сравнивали с исходными сортами и гибридами. Был проведен анализ пораженности всходов корневыми гнилями. Сравнивали поражение потомства растений-регенерантов и исходных форм. Практически на всех вариантах опыта инфекция значительно преобладала на контрольных вариантах- на исходных сортах и гибридах. Всходы этих сортов поражались в большей степени, чем растения-регенеранты, прошедшие отбор на селективных фонах. Также был проведен учет распространения и развития болезни в фазу полной спелости зерна. Уборка проведена вручную,серпом. Каждая делянка учитывалась на количество стеблей, урожайность, пораженность корневыми гнилями. Учет анализа пораженности показал, что по всем линиям растений-регенерантов степень поражения была ниже, чем у исходных сортов. Меньше было и развитие болезни. Признаки поражения были не такие сильные, как у исходных сортов. Поражение проявлялось в почернении подземного междоузлия, побурении корней,побурении узлов кущения, появлении глубоких штрихов и пятен на стебле (фиг.5). Таким образом, изобретение представляет новый штамм гриба, предназначенный для использования в клеточной селекции на устойчивость пшеницы к фузариозной корневой гнили и рекомендован в качестве типового фитопатогенного штамма. Полученный штамм обладает всеми типичными для грибов видахарактеристиками, имеет стабильные морфолого-культуральные признаки, при культивировании формирует мицелиальную пленку с хорошо развитым воздушным мицелием, активным спороношением. Обладает высокой патогенностью по отношению к растениям пшеницы. Для постановки клеточной селекции пшеницы в качестве селективного агента предлагается использовать высокотоксичный культуральный фильтрат штамма 3 гриба,полученный на среде Чапека с сахарозой. Штамм 3 может быть рекомендован в качестве типового фитопатогенного штамма при создании искусственного инфекционного фона в процессе культивирования изолированных клеток, тканей в условияхи в качестве тест-культуры при создании инфекционного фона в полевых условиях. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гриба ,3 (РГКП Республиканская коллекция микроорганизмов Министерства образования и науки Республики Казахстан, регистрационный номер 169), для клеточной селекции пшеницы на устойчивость к фузариозной корневой гнили.