Штамм гриба Bipolaris sorokiniana В1.4, используемый в качестве тест-культуры для клеточной селекции пшеницы на устойчивость к гельминтоспориозной корневой гнили

(51) 12 1/14 (2006.01) 01 63/04 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ устойчивых к гельминтоспориозной корневой гнили, и может быть рекомендован при создании искусственного инфекционного фона в лабораторных условиях. Технической задачей изобретения являлось выделение штамма возбудителя гельминтоспориозной корневой гнили -из пораженных тканей растений яровой мягкой пшеницы произрастающих в Северном Казахстане,отвечающего требованиям стабильность морфолого-культуральных признаков,хороший рост и спороношение,высокая патогенность и фитотоксичность, способность сохранять свои свойства при пересевах. Учитывая актуальность проблемы получения устойчивых к гельминтоспориозной корневой гнили новых форм пшеницы, выделен штамм гриба.4, который обладает стабильными культуральными свойствами,морфологическими признаками, является высоко токсигенным и патогенным. Культуральный фильтрат штамма гриба.4 рекомендуется использовать в клеточной селекции пшеницы в качестве селективного агента. Штамм гриба.4 не является производственным штаммом.(72) Ремеле Валентина Ванифатьевна Саданов Аманкелди Курбанович Сейтбатталова Айнур Исламовна Созинова Любовь Феодосьевна Турганбаева Асия Каирбековна Хапилина Оксана Николаевна Шек Галина Оразтаевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Авторское свидетельство РФ 1805850,кл. 01 63/04, 12 1/14, 1993 В 1.4, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-КУЛЬУРЫ ДЛЯ КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ ПШЕНИЦЫ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ГЕЛЬМИНТОСПОРИОЗНОЙ КОРНЕВОЙ ГНИЛИ(57) Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и представляет собой новый штамм гриба, предназначенный для получения методом клеточной селекции новых форм пшеницы, 20997 Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и представляет собой новый штамм гриба, предназначенный для получения методом клеточной селекции новых форм пшеницы, устойчивых к гельминтоспориозной корневой гнили, и может быть рекомендован в качестве типового фитопатогенного штамма при создании искусственного инфекционного фона в лабораторных условиях. Гельминтоспориозная (обыкновенная) корневая гниль злаковых культур инфекционное заболевание,приводящее к загниванию,разрушению корневой и прикорневой частей растений, в результате чего наблюдается угнетение растений,белостебельчатость,белоколосица,задержка колошения, щуплость зерна, а также гибель продуктивных стеблей. В условиях Северного Казахстана заболевание вызывается микроскопическими грибами вида наиболее распространенный и вредоносный вид из рода. Обыкновенная корневая гниль,вызываемая, часто развивается в эпифитотийной форме. Эпифитотии наблюдали в ряде штатов Западной Австралии, США, прериях Канады, на Алтае, в Западной Сибири, на Урале, в Северном Казахстане. Интенсивное развитие болезни приводит к ежегодным потерям урожая зерна более 20-30. продуцирует ряд токсичных веществ различной природы, действие которых проявляется в ингибировании у растений процессов дыхания,фотосинтеза, нарушении азотного и углеводного обмена, целостности клеточных мембран, а также вызывают нарушения митотического цикла в меристемах. Все это служит причиной задержки роста и развития растений. В настоящее время получение форм пшеницы,устойчивых к воздействию микроскопических грибов, традиционными методами затрудняется ввиду полигенности наследования признака устойчивости, отсутствия доноров устойчивости. Наиболее эффективным и экономичным способом защиты пшеницы от гельминтоспориозной корневой гнили является создание иммунных сортов на основе методов биотехнологии, которая позволяет значительно расширить возможности традиционной селекции при получении новых генотипов растений,устойчивых к корневой гнили. Метод клеточной селекции с использованием культурального фильтрата грибапозволяет получать растения пшеницы, устойчивые к патогену. Для проведения исследований по клеточной селекции на устойчивость к грибуважным этапом является наличие типового фитопатогенного штамма, вызывающего адекватную реакцию растительного организма как в условиях, так и в условиях. 2 Необходимо, чтобы такой штамм был доступен для постановки исследований, имел определенные показатели фитотоксичности, фитопатогенности,был отзывчивым к культивированию в условиях, сохранял свои свойства в процессе хранения. В связи с этим проблема получения нового штамма фитопатогенных грибов, отличающегося высокой патогенностью и интенсивным токсинообразованием,для получения болезнеустойчивых форм мягкой пшеницы является одной из актуальных задач биотехнологии растений. Аналогом предлагаемого изобретения является штамм гриба(,) , используемый для оценки устойчивости яровой пшеницы к корневой гнили(Лангольф Э.И., Христов Ю.А. Штамм гриба(,)для оценки устойчивости яровой пшеницы к корневой гнили // РФ, Авторское свидетельство 1805850, МПК 12 1/14,Сибирский НИИ растениеводства и селекции НПО Селекция СО Российской сельскохозяйственной академии з. 01.07.91, публ. 30.03.93). Отличие нашего штамма от аналога заключается в том, что он выделен из пораженных растений яровой мягкой пшеницы, возделываемых в зоне Северного Казахстана, и предлагается для использования в качестве типового фитопатогенного штамма при проведении клеточной селекции мягкой пшеницы на устойчивость к гельминтоспориозной корневой гнили. Задача изобретения - выделение штамма возбудителя гельминтоспориозной корневой гнилииз пораженных тканей растений яровой мягкой пшеницы произрастающих в Северном Казахстане, отвечающего требованиям стабильность культурально-морфологических признаков, хороший рост и спороношение, высокая патогенность и фитотоксичность, способность сохранять свои свойства при пересевах. Для получения такого штамма было изучено 98 изолятов грибов, выделенных из пораженных растений пшеницы различных сортов в различные фазы развития. Для дальнейших исследований были отобраны изоляты,сохраняющие свои культурные свойства в течение ряда пересевов - . 1.4 В 2.5 В 2.7 В 3.2 В 3.3 В 5.3 В 8 и В 10. Для проведения клеточной селекции пшеницы на устойчивость к корневой гнили нами выделен штамм грибаВ 1.4, обладающий стабильностью культурально-морфологических свойств, сохраняющий свои биологические свойства при пересевах и создании инфекционного фона. Культуральный фильтрат штамма гриба В 1.4 обладает высокой фитотоксичностью в отношении каллусных культур и растений мягкой пшеницы,высокой ферментативной активностью, что позволяет использовать данный штамм для получения 20997 болезнеустойчивых форм пшеницы методами клеточной селекции. Штамм гриба 1.4 не является производственным штаммом. Штамм гриба 1.4 выделен из пораженных корневой гнилью растений пшеницы сорта Астана,выращенного в условиях Акмолинской области. Идентификацию грибапроводили на основании культуральных,морфологических признаков, макроскопические особенности штамма гриба изучали на жидкой и агаризованной среде Чапека, картофельном агаре,микроморфологические - методами световой микроскопии. Штамм гриба 1.4 депонирован,хранится в Республиканской коллекции микроорганизмов РГП Национальный центр по биотехнологии Республики Казахстан(010000, г. Астана, ул. Ш.Валиханова, 43) под регистрационным номером 165 и характеризуется следующими свойствами. Пример 1. Морфолого-культуральные свойства штамма грибаВ 1.4. На агаризованной среде Чапека формируется распростертая, интенсивно растущая колония. Цвет конидиального газона меняется от оливковозеленого в молодом возрасте до оливкового,интенсивно черного в зрелом. Имеются концентрические круги более светлых оттенков. Обратная сторона колонии оливковая. Конидии вариабельные по форме, обратнояйцевидные,цилиндрические, 3-9 перегородок, прорастают латерально. Конидиеносцы прорастают рядом с порой (фиг. 1). Для накопления токсичных метаболитов штамма грибаВ 1.4 в культуральной жидкости была использована питательная среда Чапека с различными источниками углерода сахарозы, глюкозы, мальтозы, лактозы, крахмала,глицерина, которые добавляли в количестве,эквивалентном содержанию 30 г/л сахарозы. Установлена зависимость интенсивности роста от вида азотных соединений мицелиальная пленка меняется от блинообразной до ее полного отсутствия, цвет субстратного мицелия - от оливкового до бежевого иногда светло-розового оттенка, культуральная жидкость - от бесцветной прозрачной до зеленого цвета. Наибольшая мицелиальная масса получена на среде с нитратом калия - 357 мг, наименьшая - на среде с сернокислым аммонием - 33 мг (таблица 1). Кроме того,установлено, что нитраты калия и натрия вызывают подщелачивание среды, в то время как аммонийные формы азота вызывают смещение уровня рН в кислую сторону. Штамм грибаВ 1.4 имеет различные морфолого-культуральные признаки, в зависимости от источников углерода в среде образуются колонии и культуральные жидкости,различающиеся между собой по органолептическим характеристикам. Наибольшая биомасса накапливалась на варианте среды с крахмалом - 390 мг, наименьшая - на среде с мальтозой 57 мг. Установлено, что гриб хорошо усваивает глюкозу,крахмал, сахарозу и лактозу, хуже - мальтоза и глицерин. Таблица 1 Накопление биомассы штаммом грибаВ 1.4 на средах с различными источниками азота Источник азота в среде Пример 2. Фитотоксичные свойства штамма грибаВ 1.4. Штамм гриба 1.4 отличается стабильно высокой фитотоксичностью к проросткам пшеницы при всех концентрациях культурального фильтрата(от 10 до 100). Поражение проростков пшеницы мягкой сорта Акмола - 2 в лабораторных опытах составило 58,9(ростки) и 66,67 (корешки) при интенсивности развития болезни 22,5, патогенности 66,67, и снижении всхожести на 46,6 в сравнении с контролем. Культивирование штамма грибаВ 1.4 в условиях аэрации приводит к возрастанию фитотоксичных свойств культуральной жидкости и сокращению периода культивирования с трех недель до одной недели. Фитотоксичность культуральных фильтратов штамма гриба 1.4 при различных источниках азота составила 82,5-98,9, снижение всхожести в сравнении с контролем в пределах 25,3-5,50, ингибирование роста корней на 86,4-99,6. Установлена зависимость фитотоксичности культуральной жидкости на средах с различными источниками углерода. Наиболее высокая токсичность наблюдалась на вариантах сред с глюкозой и глицерином (фиг. 2). Установлен разнообразный рост штамма В 1.4 при различных сочетаниях продолжительности и температуры культивирования. Сила влияния температуры -40,7 при наиболее благоприятных значениях 1828 С,продолжительности культивирования -50,1. Штамм гриба 1.4 является активным продуцентом амилолитических и целюлозолитических ферментов. Пример 3. Фитопатогенная активность штамма грибаВ 1.4. Для определения фитопатогенных свойств штамма гриба 3 20997 В 1.4 выращивали растения пшеницы сорта Акмола 2 в почве, инокулированной мицелием. Определяли всхожесть,взвешивали массу ростков и корешков проростков, а также патогенность и развитие болезни гриба. Патогенность к растениям пшеницы у штамма В 1.4 составила 66,7 при интенсивности развития болезни 22,5. Штамм В 1.4 грибаобладает патогенными свойствами по отношению к растениям мягкой и твердой пшеницы, ячменя, овса,кукурузы. Относится к облигатным сапрофитам и не является патогенным для человека и животных. Пример 4. Влияние культурального фильтрата штамма грибаВ 1.4 на каллусные ткани. При проведении клеточной селекции было использовано более 4400 каллусов,индуцированных из зрелых и незрелых зародышей семян 5 сортов и 9 гибридов мягкой пшеницы. Определены оптимальные концентрации культурального фильтрата штамма В 1.4 в среде для культивирования 5-30. Выживаемость каллусов мягкой пшеницы составила 54,6-85,7,относительный прирост биомассы варьировал в пределах 3,03-36,4. Превышение концентрации культурального фильтрата выше 30 и более процентов значительно снижало выживаемость каллусных тканей. Установлено фитотоксичное действие культурального фильтрата штамма В 1.4 грибана каллусные ткани мягкой пшеницы,проявляющееся в снижении каллусообразующей способности (от 3,6 до 34,3), приросте биомассы по отношению к конотролю (от 9,5 до 34,4). Культуральный фильтрат штамма В 1.4 грибавызывает изменение роста каллусных тканей некроз, потерю морфогенности, ризогенез (фиг. 3). Выявлены изменения в микроморфологическом строении каллусных клеток,интенсивности образования морфогенных зон, что приводит к снижению регенерационного потенциала каллусных клеток. Культуральный фильтрат штамма грибаВ 1.4 можно эффективно использовать в качестве селективного фактора при проведении клеточной селекции на устойчивость к корневой гнили пшеницы. Пример 5. Эффективность использования культурального фильтрата В 1.4 в клеточной селекции при получении устойчивых к гельминтоспориозной корневой гнили форм пшеницы. Устойчивость растений-регенерантов к возбудителю корневой гнили пшеницы - грибу была проверена на инфекционных фонах. Были тестированы растениярегенеранты пятого поколения. Определяли степень поражения растений корневыми гнилями,продуктивность растений, сравнивали с исходными сортами и гибридами. Оценка устойчивости линий на инфекционном фоне и их продуктивности, показала преобладание в потомствах большей устойчивости к заболеваниям по сравнению с исходными формами. Распространение болезни и интенсивность поражения у растений-регенерантов были значительно ниже в сравнении с исходными формами, не прошедшим отбор на селективных фонах. Наибольшее повышение устойчивости на фоне высокой продуктивности наблюдали у растений-регенерантов Л.87/93. Учет анализа пораженности показал, что по всем линиям растений-регенерантов степень поражения была ниже, чем у исходных форм. Меньше было и развитие болезни. Признаки поражения были не такие сильные, как у исходных сортов (таблица 2). В результате клеточной селекции с использованием культурального фильтрата штамма грибаВ 1.4 достигнуто значительное повышение устойчивости, которая сохраняется до 5-го поколения. Таким образом, изобретение представляет новый штамм гриба, предназначенный для использования в клеточной селекции на устойчивость пшеницы к гельминтоспориозной корневой гнили, который может быть рекомендован к использованию в качестве типового фитопатогенного штамма. Полученный штамм обладает всеми типичными для грибов видахарактеристиками,имеет стабильные морфолого-культуральные признаки,отличатся хорошим ростом и токсинообразованием в условиях,способностью сохранять свои свойства при хранении, высокую фитопатогенность в сочетании с высокой фитотоксичностью к каллусным тканям и растениям мягкой пшеницы, что позволяет использовать его для проведения клеточной селекции на устойчивость к корневой гнили. Таблица 2 Характеристика линий растений-регенерантов мягкой пшеницы, полученных в процессе клеточной селекции с использованием культурального фильтрата штамма грибаВ 1.4 Генотип Диас 2 исходная форма Диас 2 с 5 55 Диас 2 5 57 Диас 2 с 5 56-4 Интенсивность Распростр Оценка устойчивости поражения анение линий к корневой Восприимчивый Устойчивый Устойчивый Устойчивый Диас 2 с 5 58 Скала БР исходная форма Скала БР с 10 3-1 СкалаБР с 10 8-4 Скала БР с 10 55-2 Л. 87/93 исходная форма Л. 87/93 с 5 2 Л.87/93 5 3 Л. 87/93 5 4-1 Л.87/93 с 5 4-2 Для проведения клеточной селекции пшеницы в качестве селективного агента предполагается использовать высокотоксичный культуральный фильтрат штамма грибаВ 1.4,полученный на среде Чапека с сахарозой. Штамм гриба.4 может быть рекомендован в качестве типового фитопатогенного штамма при создании искусственного инфекционного фона в процессе культивирования изолированных клеток, тканей в условиях. Штамм грибаВ 1.4,депонированный в Республиканской коллекции микроорганизмов Министерства образования и науки Республики Казахстан 165, используемый в качестве тест-кульуры для клеточной селекции пшеницы на устойчивость к гельминтоспориозной корневой гнили.