Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L., – продуцент моноклональных антител к белковому антигену Bac. subtilis

(51) 12 5/06 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине при проведении экспресс исследования биоматериала на наличие либо отсутствие бацилл (патогенных,сапрофитов) в объектах внешней среды, продуктах питания животного и растительного происхождения. Штамм гибридных культивируемых клеток получают путем слияния иммунных лимфоцитов мыши линии / с клетками миеломной линии Х 63-8 и используют как продуцент моноклональных антител к.(72) Бакирова Гульнар Аманжоловна Сарина Нургуль Искаковна Муканов Касым Касенович Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ 22181 Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине при проведении экспресс исследования биоматериала на наличие либо отсутствие бацилл (патогенных, сапрофитов) в объектах внешней среды, продуктах питания животного и растительного происхождения. Штаммов гибридом продуцирующие моноклональные антитела специфичных к Вас.используемых для дифференциальной диагностики и выявления Вас.в объектах внешней среды с использованием моноклональных антител в нашей стране и за рубежом нет. Бактерии Вас.широко распространены в воде, воздухе, почве, пищевых продуктах, а также выделяются из организма человека и животных. Они известны как продуценты антибиотиков,ферментов и других биологически активных веществ. Имеются сообщения, свидетельствующие о том, что среди представителей группы Вас.нередко встречаются культуры, которые могут вызвать пищевые отравления, служит причиной поствакциональных поражений нервной системы. С ним связывают случай септицемий у больных со злокачественными новообразованиями и у новорожденных. Бактерии Вас.осложняют течение различных заболеваний,вызывая дополнительные патологические процессы. Нередко в медицинской практике при исследовании микробных культур изолированных из организма больного или из продуктов, подозреваемых в качестве причины отравлений, споровые бактерий группы Вас.рассматриваются как контаминанты. В связи с этим они детально не изучаются и с ним, следовательно, не связывают конкретные случаи заболеваний. Нередки случаи отнесения выделенных споровых бактерий к виду Вас.лишь на том основании, что патогенные свойства последних в литературе описаны детально,а дифференциация видов Вас.и Вас.затруднительна. Недооценка исследователями и практическими работниками возможной этиологической роли Вас.затрудняет оценку их значения в развитии некоторых заболевании человека и животных (Смирнов В.В., Резник С.Р.,Сорокулава И.Б. Методические рекомендации по выделению и идентификации бактериальных групп Вас.из организма человека и животных). Диагностика и дифференциация бацилл(патогенных и сапрофитных) основана на следующих методах иммунофлюоресценции,реакции преципитации,реакция диффузной преципитации, бактериологические и биологические методы. К недостаткам приведенных методов относятся их трудоемкость, низкая чувствительность и специфичность, а также длительность в получении результатов. Анализ и выделение эпитопов,ответственных за дифференциацию различных видов бацилл, может служить основой для разработки более эффективных и специфичных методов дифференциальной диагностики бацилл. Выделить такие антигены физико-химическими методами практически невозможно. 2 На сегодняшний день надежным и реальным инструментом в совершенствовании методов диагностики являются моноклональные антитела,которые уже широко находят свое применение в диагностике особо опасных инфекционных болезней человека и животных. Как правило,диагностикумы на основе моноклональных антител характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью. С этой точки зрения создание диагностической тест-система на основе моноклональных антител позволит проводить экспресс исследования биоматериала на наличие либо отсутствие бацилл (патогенных, сапрофитов) в объектах внешней среды, продуктах питания животного и растительного происхождения. Известны штаммы гибридом, продуцирующие моноклональные антитела (МКА) к галактоза-ацетилглюкозаминовому полисахариду клеточной стенки( .,., .,,..223-231). Однако исследователями установлено, что полисахаридный комплексимеет серологическое и химическое родство с полисахаридами сапрофитных спорообразующих бацилл ( ,и др.) и пневмококкамитипа, поэтому моноклональные антитела данной группы гибридом не могут быть использовны для видовой идентификации бактерий рода . Задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующего моноклональные антитела к белковому антигену Вас.с целью их видовой идентификации. Штамм получают следующим образом. Мышам линии / в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг белкового антигена Вас. , в 0,1 мл полного адьюванта Фрейнда и 0,5 мл забуференном физиологическом растворе (ЗФР), рН 7,2-7,4. Смесь взбивают до образования творожистой массы. На 7,11, 12, 13-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг антигена в ЗФР, рН 7,2-7,4. Спустя 3 дня после последней иммунизации спленоциты мышей, которые дают более высокие титры антител по ИФА используют для гибридизации. Гибридизацию проводят добавлением 1-го мл раствора, содержащего 45 полиэтиленгликоля 4000 и 10 диметилсульфоксид и 45 -1640 к смеси состоящего из 4106 клеток -63.-8 5.6.3. и 20 х 106 спленоцитов в течение 1 минуты. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля их высевают в ячейки 96-луночной панели. На следующий день в эти лунки вносят среду с гипоксантином,аминоптерином и тимидином (ГАТТ). Через 10-14 дней после слияния в лунках, имеющих колонии клеток размером 2-3 мм, отбирают культуральную среду для определения продуктивности гибридных 22181 клеток. Тестирование проводят методом твердофазного ИФА с использованием белкового антигена Вас.и кроличьих иммуноглобулинов к антителам мыши,меченых пероксидазой хрена. В течение 21 дня после слияния, клетки находятся в среде ГАТТ. Затем постепенно клетки переводят на среду гипоксантинтимидин (ГТ) и полную среду -1640. Клоны клеток, продуцирующих моноклональные антитела,трижды клонируют методом лимитирующих разведений. После третьего клонирования 60 субклонов продуцируют антитела к тестируемому антигену. Штамм гибридных клеток продуцирует антитела в культуральную среду. Продуктивный клон гибридомы обозначают / - 22. Штамм гибридных клеток / - 22 депонирован и хранится в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан(010000, г.Астана, ул. Ш. Валиханова,43) под регистрационным номером- 0224 и характеризуется следующими свойствами. Морфологическая характеристика. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные свойства. Гибридные клетки выращивают в среде -1640, содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-20) 20 мл/л 200 мМ глютамина- 3,375 г/л 2-меркаптоэтанола 3 мкл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия- 3,7 г/л. Клетки культивируют при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация 2105 клеток в 1 мл. Частота пассирования через 3-4 суток. При внутрибрюшинном введении сингенным мышам штамм гибридомы образует опухоль в асцитной форме на 14 - 16 день. Доза клеток при прививке - 2105 клеток. За 14 дней до введения гибридомы мышам вводят внутрибрюшинно 2,6,10,14 - тетраметилпентадекан в дозе 0,5 мл на голову. Штамм сохраняет способность продуцировать специфические моноклональные антитела в течение 4 пассажей на сингенных мышах (время наблюдения). Продуктивность штамма. На 8 день культивирования гибридомы, концентрация антител достигает 25 мкг/мл в культуральной среде. Концентрация моноклональных антител по белку очищенных из асцитной жидкости составляет 8 мг/мл. Титр иммуноглобулинов в культуральной среде 132, а в асцитной жидкости титр антител достигает до 112 800. Характеристика полезного продукта. Синтезируемые штаммом гибридомы моноклональные антитела относятся к классу , подклассу 1. Константа связывания(аффинность) моноклональных антител по отношению к белку Вас.составляет 110 8 М-1. Методы оценки специфичности МКА иммуноблотинг, непрямой и сэндвич варианты ИФА. Контаминация. Контаминантов в клетках включая, бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружено. Криоконсервация. К осадку гибридных клеток добавляют эмбриональную сыворотку коров, и затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10. Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимися крышками по 2105 клеток в объеме 1 мл. Ампулы помещают в коробку из пенопласта и оставляют на сутки при -70 С, а затем переносит в жидкий азот. Условия размораживания. Замороженную ампулу быстро помещают в водяную баню при 37 С. После размораживания, суспензию клеток переносят стерильно в пробирку, содержащую 10 мл холодной бессывороточной среды -1640,отмывают один раз и засевают в ячейки 24 луночной планшеты с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 60. Штамм гибридных культивируемых клеток/ - 22 используют следующим образом. Пример 1. Гибридные клетки высевают в пластиковые матрасы площадью по клеток в мл питательной среды и инкубируют 3 дня при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Суспензию клеток с культуральной средой собирают и центрифугируют 10 минут при 800 с целью отделения клеток от надосадочной жидкости, содержащей антитела. При культивировании гибридомы на мышах,иммуноглобулины из асцитной жидкости получают методом высаливания сульфатом аммония до 50 насыщения. Для этого в асцитную жидкость добавляют равный объем 0,15 М фосфатнобуферного раствора (ФБР), рН - 7,2. Затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при перемешивании на ночь при 4 С. Иммуноглобулины отделяются центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 30 минут, при 4 С. Осадок антител ресуспендируют в минимальном объеме ФБР. Пример 2. Для проведения непрямого ИФА на 96-луночную планшету для иммунологических реакций сорбируют раститрованные белковый антиген Вас. . Раститровку проводят с 10 мкг/мл до 1 нг/мл и вносят по 100 мкл в лунку в 0,05 М трис , рН 7,2-7,4. Планшет инкубируют при 4 С в течение ночи. Затем планшет отмывают 3 раза в 0,005 М трис , рН 7,2-7,4 с 0,05-ным твином-20 и 3 раза в 0,005 М трис , рН 7,2-7,4. В лунки планшеты вносят по 100 мкл 10 раствора фетальной сыворотки телят для забивки свободной поверхности лунки и инкубируют в течение 1 часа при 37 С. После инкубирования повторяют процедуру отмывки. На раститрованный антиген вносят разведения моноклональных антител с 1100 до 16000 в объеме 100 мкл в 0,05 М трис ,содержащий 10 фетальной сыворотки телят и 0,05 Твин-20. После инкубации в течение 1 часа при 37 С планшету отмывают описанным способом и вносят в ячейки антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой. 3 22181 Через 1 ч повторяют процедуру отмывки с целью удаления несвязанных продуктов реакции. Антитела против белкового антигена Вас.определяют количественно по расщеплению субстрата, который готовят разведением 10 мг ортофенилендиамина в 10 мл лимонной кислоты, РН - 4,5 с добавлением 50 мкл 3 раствора перекиси водорода. Положительная реакция характеризуется коричневым окрашиванием и просчитывается при 492 нм. Результаты опыта по определению специфичности МКА в непрямом варианте ИФА представлены в таблице 1. Таблица 1 Изучение специфичности и активности МКА штамма гибридом/ -22 в культуральной жидкости Антигены после экстракции (растворимые) В.26 (хлеб) 1256 В.-20 18 Корпускулярные антигены В.6633 116 В.1/1-9 12 В.356 РО В.13/7 РО В.1459 РО В.БТ 90 РО В.12 Примечание - РО - реакция отрицательная. Как видно из таблицы 1, моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридомы/ - 22 к белковому антигену Вас. ,что позволяет получать на их основе эффективные диагностические препараты для проведения экспресс исследования биоматериала на наличие либо отсутствие бацилл (патогенных, сапрофитов) в объектах внешней среды, продуктах питания животного и растительного происхождения Пример 3. Образцы белкового антигена Вас.в количестве 10 мкг подвергают электрофорезу в 7-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Электрофореграмму переносят на нитроцеллюлозную мембрану в течение 2 часов при силе тока 60 В и 250 мА. Свободные участки носителя блокируют 1-ным бычьим сывороточным альбумином в ЗФР,рН 7,2- 7,4 (18 ч при 4 С или 2 ч при 37 С), затем 151200 1200 1400 1100 РО РО РО РО 1100 отмывают по 3 раза ЗФР и инкубируют 1,5 ч при 37 С с МКА из очищенной асцитной жидкости,разведенной 1100 ЗФР-Тв. После этого носитель отмывают 3 раза ЗФР-Тв и ЗФР, затем его выдерживают в рабочем разведении антимышиных антител, меченных пероксидазой (1 ч при 37 С). Повторяют процедуру отмывки и проявляют реакцию с помощью 4-хлор-1-нафтола. Иммунохимическое проявление фракций белков в иммуноблотинге с применением моноклональных антител и антимышиных антител, меченных пероксидазой хрена показало специфичность моноклональных антител к эпитопам белка,молекулярная масса которого соответствовала 66 кД. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гибридных культивируемых клеток животных., депонированный в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии МОН РК,0224 - продуцент моноклональных антител к белковому антигену