Способ диагностики микроделеции AZF локуса Y-хромосомы молекулярно-генетическим методом

(51) 01 33/50 (2006.01) 12 15/10 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ 1. значительно ускорить диагностическую процедуру 2. диагностировать генетический фактор бесплодия 3. использовать способ широко в практической медицине при обследовании больших групп населения. В основе метода лежит выделение тотальной ДНК и амплификация специфического участка за счет многократного повторения циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе,отжига специфических олигонуклеотидных праймеров, которые рассчитаны таким образом,что фрагменты ДНК,амплифицируемые с применением 9 -специфичных праймеровген ,ген , 84 , 86, 254 и 255 в ходе ПЦР,имеют различную длину 129 и 600 пар нуклеотидов,так же зонда и синтеза цепей ДНК с помощью фермента -полимеразы, результаты амплификации оценивают методом электрофареза в 7 полиакриламидном геле. Изобретение обладает большей специфичностью,позволяет проводить диагностику в более короткие сроки и широко использовать в практической медицине.(76) Абильдинова Гульшара Жусуповна Баянова Миргуль Файзуллиновна Камалиева Бакытгуль Омаровна Вибе Александр Петрович Боровикова Анна Викторовна(56) Кузнецова Т.В., Логинова Ю.А., Чиряева О.Г. и др. Цитогенетические методы. Медицинские лабораторные технологии и диагностика. // Интермедика, СПб, 1999, ч.2, с.550-578 ЛОКУСА ХРОМОСОМЫ МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИМ МЕТОДОМ(57) Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской генетике. Данный способ может быть использован для дифференциальной диагностики генетического фактора бесплодия у мужчин фертильного возраста. Задачей изобретения является разработка способа диагностики микроделеции локусахромосомы молекулярно-генетическим методом. Предложенный способ диагностики микроделеции локуса (,в,)хромосомы молекулярно-генетическим методом позволяет Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской генетике. Данный способ может быть использован для дифференциальной диагностики генетического фактора бесплодия у мужчин фертильного возраста. Известен способ диагностики микроделеции локусахромосомы молекулярно-генетическим методом. Для определения нуклеотидной последовательности используются 9 пар праймеров. Метод состоит из нескольких этапов. Первый этап выделение тотальной ДНК. Второй этап амплификация геномного ДНК. Третий этап проведение электрофореза на 7 полиакриламидном геле, детекция результата. (Кузнецова Т.В.,ЛогиноваЮ.А., Чиряева О.Г. и др. Цитогенетические методы. Медицинские лабораторные технологии и диагностика. Интермедика Ст-Петербург 19992550578) Совпадающими признаками являются этапы амплификации ДНК и приготовление реакционной смеси с использованием набора праймеров и полимеразы. Недостатком известного способа является то, что в известной методике время электрофореза не менее 1,5 часов. Новизной предлагаемого способа является изменение соотношение составляющих смеси сток-раствора 191-19 гр акриламида и 1 гр бисакриламида. В результате достигается экономия времени исследования до 30 минут, соответственно ускоряется срок выдачи результата. Задачей изобретения является разработка способа диагностики микроделеции локусахромосомы молекулярно-генетическим методом. Сущностью данного изобретения является обнаружение микроделециихромосомы локуса(а, в, с). Высокая специфичность метода мультиплексной ПЦР задается нуклеотидной последовательностью праймеров и специально отрабатываемыми при создании ПЦР-тест-системы условиями их присоединения к строго специфическому для данного фрагмента ДНК(мишени). По отсутствию в реакционной смеси специфического фрагмента ДНК делают заключение в исследуемом материале о делеции определенного участка. В основе метода лежит амплификация специфического участка за счет многократного повторения циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров), которые рассчитаны таким образом, что фрагменты ДНК, амплифицируемые в ходе ПЦР, имеют различную длину 129 и 600 пар нуклеотидов,так же зонда,меченного флуоресцентным красителем и синтеза цепей ДНК с помощью фермента - полимеразы. Приготовление общей смеси ПЦР На 1 пробу необходимо- ПЦР буфер - 2,5 мкл- 1,25 мкл объем праймеров - 0,5 мкл объемполимеразы - 0,1 мкл объем Н 2 - 7,5 мкл. Общий объем на 1 пробирку - 11,0 мкл Шейкируем, центрифугируем. Добавляем объем ДНК- 1,0 мкл, объем контроля 1,0 мкл. Общий объем на 1 пробирку - 12,2 мкл. Минеральное масло - 30 мкл. Центрифугируем. 3. Электрофорез. Приготовление исходных растворов для 7 ПААГ (полиакриламидный гель) необходимо 191 сток-раствор смеси 19 гр акриламида и 1 гр бисакриламида, объем довести до 100 мл д.Н 2 10 раствор персульфата аммония (ПСА) 1 гр ПСА 10 мл д. Н 2 краска-буфер для нанесения проб 2,5 мгр бромфеноловый синий (сух) 3 гр глицерина 0,1 мл ТРИС 0,02 мл 0,5 М ЭДТА. Приготовление 7 ПААГ 10,5 мл 191 стокраствор АА/БА 29,5 мл д. Н 2 4,5 мл 10 ТВЕ 50 мкл ТЕМЕД 450 мкл 10 ПСА. Провести электрофоретическое разделение продуктов амплификации при напряжении 270 В,16 Всм, 30 мин. Таким образом, предложенный способ диагностики микроделеции локуса хромосомы молекулярно-генетическим методом позволяет 1. значительно ускорить диагностическую процедуру 2. диагностировать генетический фактор бесплодия 3. использовать способ широко в практической медицине при обследовании больших групп населения. Молекулярно-генетические исследования микроделециихромосомы были проведены 50 мужчинам с патозооспермией с нормальным кариотипом - 46,ХУ. По результатам наших исследований у мужчин с показаниями азооспермия и тяжелая олигозооспермия,микроделеции хромосомы обнаружены у 7 пациентов. Наиболее часто встречалась микроделецияс- субрегиона в 44, и с одинаковой частотой равной 14 встречались микроделеций,,а. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики микроделециилокуса хромосомы молекулярно - генетическим методом,включающий выделение геномной ДНК из периферической крови, применение мультиплексной ПЦР, амплификацию ДНК, оценку результатов методом электрофореза в 7 полиакриламидном геле,отличающийся тем, что исследуют -специфичные маркерыген,ген, 84 , 86, 254 и 255 , изменяют соотношение акриламида и бисакриламида 191 соответственно в сток-растворе, и, через 30 минут при отсутствии в реакционной смеси специфического фрагмента ДНК, диагностируют микроделециилокуса - хромосомы.