Способ ранней неинвазивной пренатальной диагностики активной копии RhD гена

(51) 01 33/50 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ гена по свободноциркулирующей фетальной ДНК в сыворотке матери позволяет выявить наличие активной копиигена плода в крови матери, за счет изменения соотношения суспензии ДНК с реакционной смесью снизить вероятность ошибки и повысить чувствительность, использовать данный способ для ранней диагностики и профилактики резус-конфликта, широко использовать способ в практической медицине. Способ выполняется следующим образом выделяют тотальную ДНК из периферической крови матери, проводят денатурацию ДНК, применяют прямой, обратный праймеры и ДНК зонда для амплификации, оценку результатов амплификации по 40 циклам и детекцию ДНК проводят по графическому изображению кривых, отличается тем,что исключают этап начальной денатурации,увеличивают количество циклов амплификации до 43, для реакции используют 13,8 мкл, исключают из реакционной смеси воду, что позволяет уменьшить общее количество реакционной смеси до 29 мкл.(76) Абильдинова Гульшара Жусуповна Баянова Миргуль Файзуллиновна Камалиева Бакытгуль Омаровна Вибе Александр Петрович Боровикова Анна Викторовна(54) СПОСОБ РАННЕЙ НЕИНВАЗИВНОЙ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ АКТИВНОЙ КОПИИГЕНА(57) Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской генетике, акушерству и гинекологии. Данный способ может быть использован для ранней диагностики и профилактики резус-конфликта плода. Задачей изобретения является разработка способа ранней неинвазивной пренатальной диагностики активной копиигена. Предложенный способ ранней неинвазивной пренатальной диагностики активной копии(без риска осложнений, как для плода, так и для самой женщины) и анализируют на наличие генапо свободноциркулирующей ДНК плода в материнской плазме. Методика проведения. На 1 реакцию требуетсяДНК, выделенная из плазмыПрямой праймерОбратный праймерЗонд 1. Приготовление раствора праймеров (прямой и обратный) и зонда 18 мкл прямого праймера 18 мкл обратного праймера 5 мкл зонда 59 мкл ТЕ буфера 2. Приготовление реакционной смеси. На 1 реакцию- 13,8 мклРаствор праймеров и зонда -2,5 мклРНК-аза Р-2,5 мкл 3. Приготовить стрипы. В каждую лунку добавить 18,8 мкл реакционной смеси 10 мкл ДНК пациента Общее количество раствора в лунке 29 мкл. Таким образом, предложенный способ ранней неинвазивной пренатальной диагностики активной копиигена по свободноциркулирующей фетальной ДНК в сыворотке матери позволяет 1. Выявить наличие активной копиигена плода в крови матери 2. За счет изменения соотношения суспензии ДНК с реакционной смесью снизить вероятность ошибки и повысить чувствительность 3. Использовать данный способ для ранней диагностики и профилактики резус-конфликта 4. Широко использовать способ в практической медицине. В группу исследования вошли 23 пациентки,обратившиеся в ННЦМД по поводу тактики и ведения беременности, решения вопроса о пролонгировании беременности. В таблице 1 представлены показания и результаты обследования с применением молекулярно-генетических и серологических методов. Таблица 1 Результаты обнаружения генапо свободной циркулирующей ДНК плода в материнской плазме Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской генетике, акушерству и гинекологии. Данный способ может быть использован для ранней диагностики и профилактики резус-конфликта плода. Известен молекулярно-генетический способ диагностикигена. Материалом для исследования является плазма крови беременной женщины с -отрицательным фактором крови. Метод состоит из нескольких этапов. Первый этап - выделение тотальной ДНК. Второй этап - амплификация и детекция ДНК в полимеразной цепной реакции с использованием набора праймеров и зондапроводится на аппарате Реал-Тайм ПЦР.(Клиническая лабораторная диагностика. 2010,11, с.43-46) Задачей изобретения является разработка способа ранней неинвазивной пренатальной диагностики активной копиигена по свободноциркулирующей фетальной ДНК в сыворотке матери. Совпадающими признаками являются этапы амплификации и детекции ДНК и приготовление реакционной смеси с использованием набора праймеров и ДНК зонда . Недостатком известного способа является то, что у разных людей концентрация свободноциркулирующей ДНК плода может варьировать и составляет примерно около 3 от всей ДНК, содержащейся в плазме. Новизной предлагаемого способа является отсутствие начальной денатурации, увеличение количества циклов амплификации, для реакции используются 13,8 мкл, исключение из реакционной смеси воды позволяет уменьшить общее количество раствора в лунке до 29 мкл. В результате изменяется соотношение ДНК с реакционной смесью, вследствие чего снижается вероятность ошибки. Данное изобретение позволяет проводить более точную диагностику с большей специфичностью и чувствительностью. Сущностью данного изобретения является определение -гена в свободноциркулирующей ДНК плода в крови матери на малых сроках беременности. Этот способ заключается в том, что у женщин с резус- отрицательной группой крови на малых сроках беременности (6-10 нед.) проводят- фактора у новорожденных Абс Абс 1- 1- 3-13 Как видно из материалов таблицы 1 в 65 (15) случаев у одного плода диагностирован- фактор и 14 случаяхфактор. У 17,4 (4) беременных с - фактором в одном случае у плода диагностирован - фактор и в трех случаях -фактор. В данной группе в условиях ННЦМД родился один новорожденный, резус фактор подтвержден серологическим методом. В 13 случаях (3) у беременных, помимо фактора в анамнезе отмечены мертворождения,аборты, отсутствие титра антител. У всех плодов диагностированфактор. В 4,3 случаев (1) у беременной с - фактором и ГБН в предыдущей беременности, отмечался высокий титр антител 12000, при ультразвуковом исследовании были обнаружены гепатоспленомегалия. У плода молекулярно-генетическим методом обнаруженфактор,который затем был подтвержден серологическим методом после рождения. Роды были индуцированы в сроке 32 недели. Ребенку было сделано заменное переливание крови, ребенок выписан в удовлетворительном состоянии. По результатам ранней неинвазивной пренатальной диагностики активной копиигена по свободноциркулирующей фетальной ДНК в сыворотке матери с резус-отрицательным фактором крови на ранних сроках беременности судят о необходимости проведения иммуноглобулиновой профилактики, пролонгирования беременности и обоснованности проводимого в дальнейшем лечения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ ранней неинвазивной пренатальной диагностики активной копии гена,включающий этапы выделения свободноциркулирующей фетальной ДНК из периферической крови матери, денатурацию ДНК,применение прямого, обратного праймеров, ДНК зонда для амплификации, оценку результатов амплификации по 40 циклам и детекцию ДНК по графическому изображению кривых,отличающийся тем, что исключают этап начальной денатурации, увеличивают количество циклов амплификации до 43, исключают из реакционной смеси воду, уменьшают общее количество реакционной смеси до 29 мкл.