Способ In vitro для быстрого определения состояния пациента, которое связано с инфекцией Mycobacterium tuberculosis

(51) 01 33/50 (2006.01) 01 33/569 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Способ - для быстрого определения статуса инфекциипо цельной крови с точки зрения активного или латентного туберкулеза, включающий стадии стимуляции антиген-специфической Т-клетки,которая присутствует в первом образце цельной крови, очищенным белковым производнымв присутствии антител против 28, или 28 и 49 - обработкиантиген- представляющими клетками (АРС) путем инкубации в течение от 1,5 ч до 2,5 ч, в частности, в течение 2 ч, при температуре от 35 С до 39 С, в частности, при 37 С,необязательно с добавлением С 2 - затем добавления ингибитора секреции - осуществления интенсивного смешивания и - другой инкубации в течение периода по меньшей мере 2,5 ч при температуре от 35 С до 39 С, и - определения цитокинового профиля и по продукции внутриклеточного-,и продукции внутриклеточного -2 антиген-специфической Тклеткой причем на присутствие активного туберкулеза указывает сдвиг цитокинового профиля в сторону Т-клеток, секретирующих только -,сопровождающийся уменьшением содержания Тклеток, секретирующих и -, и -2.(73) РЭД ФЛЭГ ДАЙЭГНОСТИКС ГМБХ(74) Болотов Юрий Альбертович Кульжамбекова Сауле Даниаровна Пастухова Ольга Васильевна Наурузова Гульжихан Хакимовна(54) СПОСОБДЛЯ БЫСТРОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯ ПАЦИЕНТА,КОТОРОЕ СВЯЗАНО С ИНФЕКЦИЕЙ Настоящее изобретение относится к способамдля быстрого определения состояния инфекциипо цельной крови. По статистическим данным, туберкулез (ТВС) является ведущей причиной смертности от инфекционных заболеваний во всем мире. Причем лишь примерно от 5 до 10 процентов лиц,инфицированных(фиг.1). Наличие заболевания клинически подтверждается при прямом выявлении патогена лабораторными диагностическими методами. Косвенное выявление кожными тестами или иммунологическим тестом недостаточно для клинической диагностики заболевания. Таким образом, в настоящее время технически невозможно посредством доступных диагностических тестов получить надежную информацию на краткосрочной основе, т.е., в пределах нескольких часов, о состоянии инфекции пациента с подозрением на туберкулезную инфекцию. Диагноз туберкулеза гарантируется, если доступно выявление патогенов в культуре. Однако это может быть успешно достигнуто без трудностей,если туберкулезные изменения тканей связаны с бронхиальной системой, мочевыводящими путями или кишечником, и патогены могут выделяться из организма. В противном случае, может быть предпринята попытка получения материала пункциями иглами или прямым взятием образца ткани. Ввиду медленного ростана обычных твердых средах, в этих случаях получения результата необходимо ожидать в течение 4-6 недель, а в жидких культурах выявление микобактериального роста современными способам может быть успешным уже примерно через 2 недели. При непрямом выявлении посредством кожного теста или иммунологического выявления, например,при внутрикожном туберкулиновом тесте МенделяМанту, определенное количество очищенных и фильтрованных антигенов из микобактерий(туберкулин) инъецируется в эпидермис. Если иммунная система тестируемого индивида ранее вступала в контакт с микобактериями, возникает защитная реакция с иммиграцией защитных клеток в кожу в соответствующем участке в пределах трех дней, приводя к отеку. Это представляет собой реакциютипа по Кумбсу. Уже через 6 недель после инфекции ТВС, тест может стать положительным. Пальпируемое уплотнение в участке тестирования считается положительной реакцией. Это может означать, что имеет место туберкулезная инфекция. Однако этот тест ничего не говорит о наличии заболевания. Положительная реакция на тест также возможна после противотуберкулезной вакцинации. Если кожа остается неизмененной в участке тестирования или на ней проявляется только сыпь, то это считается отрицательным результатом. В этом случае туберкулезная инфекция с высокой вероятностью исключается. Таким образом, внутрикожная туберкулиновая проба имеет лишь очень ограниченную надежность. С одной стороны, она может оставаться отрицательной именно при случаях тяжелого течения заболевания, таких как милиарный туберкулез или при иммуносуппрессии, а с другой стороны, ранее проведенная вакцинация или контакт с атипичными микобактериями приводит к ложноположительной реакции. В качестве дополнительного возможного диагностического способа, с 2005 г. были также доступны так называемые тесты с интерферономгамма (-). В этом тесте, защитные клетки из крови стимулируются смесью антигенов из. Если эти клетки ранее вступали в контакт с патогенами ввиду туберкулезной инфекции, то они образуют увеличенное количество посредника -. Его можно определить в клеточном супернатанте и в образцах крови, полученных у инфицированных индивидов, и оно находится на явно более высоком уровне, чем его количество отрицательного контроля, который следует проводить параллельно. Для стимуляции используются антигены -6(белок фильтрата культуры) и Т 7.7. Они образуются на ранней фазе инфекции и не продуцируются ни большинством так называемых нетуберкулезных микробактерий,ни вакцинационными штаммами микобактерий,используемыми для вакцинации БЦЖ. Это объясняет очень высокую специфичность тестов между действительными туберкулезными инфекциями и инфекциями,вызванными атипичными микобактериями, или иммунитетом,приобретенным вакцинацией. В настоящее время, в Европейском Союзе утверждены две системы тестирования для теста -, а именно,- ТВ- от компании, который выявляет продукцию посредством(иммуноферментного анализа),и тест от компании,который также выявляет число продуцирующих Т лимфоцитов посредством анализа , в дополнение к продукции -. В обоих тестах,кровь (--) или изолированные мононуклеарные клетки кровидолжны инкубироваться с антигенами в течение 20 часов с тем, чтобы результат теста был доступен не позже чем на следующий день. Утверждают, что чувствительность этих тестов в отношении прошлого контакта с М.находится в диапазоне от 82 до 100 в различных исследованиях,причем указывают,что специфичность у контролей с низким риском составляет 98. Однако эффективность тестов на практике связана с трудностями и неопределенностями. Временное окно для инкубации, а также необходимая постоянная температура 37 С порождают ошибки, а также необходим опыт использования способа в самой лаборатории. Поэтому, на практике указанные величины чувствительности и специфичности пока не достигаются. Как и при всех способах исследования с величинами чувствительности и специфичности ниже 100, его значимость уменьшается с увеличением частоты распространенности действительной инфекции. Поэтому, эти тесты - не подходят для применения у популяций или профессиональных групп с низкой распространенностью в каждой.В. сообщили в публикации в журнале(2007) 87, 202211,что уровень(2010), 152-161 о рекомбинантных про-апоптозных, генерирующих реакции 8 Т-клеток противВИЧ типа 1 и М.у новорожденных мышей.. сообщают в публикации в журнале 7 (2005) 1161-1169 об увеличенных специфических реакциях на продуцируемый Тклетками цитокин у пациентов с активным легочным туберкулезом из Центральной Африки.. в публикации в журнале 66, 950-961 (2005) сообщили о прямом Ехвыявлении 4 Т-клеток, специфических для -3- ограниченного цитомегаловируса и.С.и описали внутриклеточное выявление экспрессии цитокина проточной цитометрией( 34207-215 (1998). Т.. сообщили в публикации в журнале(2005) 24 529-536 о чувствительности нового коммерческого ферментно-опосредованного иммуноспота,(Т-) для диагностики туберкулеза в клинической практике.Т. Маескег. сообщили в публикации в журнале ВМС 2005, 613 о стандартизации проточноцитометрических анализов... описывают выявление антиген-специфической экспрессии продуцируемого Т-клетками цитокина с цельной крови проточной цитометрией (212 (1998) 89-98)., . сообщили, что туберкулин-специфические Т-клеточные реакции имеют низкую диагностическую специфичность у популяций,вакцинированных БЦЖ. Хотя тесты, основанные на субъединичных антигенах (например, -6, 10, могут использоваться для диагностики латентной туберкулезной инфекции, нет надежного иммунологического теста для выявления активного легочного туберкулеза. В частности,все существующие иммунологические тесты на наличие туберкулеза основаны на размере Т-клеточной реакции, в то время как диагностический потенциал качества реакции Т- клеток никогда не использовался. Это включает экспрессию поверхностного маркера и функциональность микобактериальных антиген-специфических Т-клеток 2007)Т(Потеря рецептора на туберкулин-реактивных Тклетках является маркером активного легочного туберкулеза).2(8) е 73510.1371/0000735). В заявке 2008/113119 описаны способы и наборы для измерения клеточно-опосредованного иммунитетав небольшом объеме цельной неразведенной крови, взятой у индивида. В частности, способы предназначены для измерения реакций образцов неразведенной цельной крови,имеющих объем, например, от 50 мкл до 500 мкл. Таким образом, облегчаются взятие образцов капиллярной крови и быстрое тестирование индивидов, включая детей, взрослых или пожилых людей. В заявке на патент США 2001/0006789 описан новый подход к оценке антигенспецифических Т-клеток, который количественно определяет и характеризует эти клетки с беспрецедентной отчетливостью, и, что особенно важно, ввиду того, что он выполняется в цельной крови, он подлежит повседневному применению в клинической иммунологической лаборатории. Эта методология предоставляет усовершенствованный цитометрический анализ внутриклеточного цитокина в цельной крови, который может одновременно измерять множественные субпопуляции Т-клеток,экспрессирующие множественные цитокины из одной культуры цельной крови. Оценка антиген- специфических реакций цитокинов в цельной крови имеет важное преимущество оценки активации Т-клеток в присутствии всех типов представляющих аутологичный антиген МНС (главного комплекса гистосовместимости) клеток, присутствующих в нативном образце. Он также имеет преимущество обеспечения возможности получения культуральной системы (цельной крови), которая может отражать воздействия системных сред (т.е., лекарственного усиления или подавления) на Т-клеточные реакции на специфические стимулы, включая антиген, путем или культивирования в присутствии такого лекарственного средства, или анализа крови человека или животного, получающего такое лекарственное средство. Целью настоящего изобретения является разработка способа, который избегает недостатков уровня техники и предоставляет быстрый и надежный способ диагностики,который дополнительно обеспечивает возможность дифференцировки между острой инфекцией и латентной инфекцией. Эта цель достигается способом - для быстрого определения статуса инфекциииз цельной крови с точки зрения активного или латентного туберкулеза,включающим стадии- стимуляции антиген-специфической Т-клетки,которая присутствует в первом образце цельной крови, очищенным белковым производнымв присутствии антител против 28, или 28 и 49- обработкиантиген-представляющими клетками (АРС) путем инкубации в течение от 1,5 ч до 2,5 ч, в частности, в течение 2 ч, при температуре от 35 С до 39 С, в частности, при 37 С,необязательно с добавлением С 2- затем добавления ингибитора секреции- осуществления интенсивного смешивания и- другой инкубации в течение периода по меньшей мере 2,5 ч при температуре от 35 С до 39 С, и- определения цитокинового профиля и по продукции внутриклеточного -, и по продукции внутриклеточного -2 (интерлейкина-2) антигенспецифической Т- клеткой причем на присутствие активного туберкулеза указывает сдвиг цитокинового профиля в сторону Т-клеток,секретирующих только , сопровождающийся уменьшением содержания Т-клеток, секретирующих и -, и . В одном варианте осуществления способа в соответствии с изобретением, другая стимуляция, , -6 -10 и/или антигеном вакцинации может осуществляться в дополнение к указанной стимуляции . Это может быть показано,когда присутствуют антигенспецифические клетки, для решения того, появились ли они вследствие контакта с нетуберкулезными микобактериями, или вследствие реакции на вакцинацию. В другом варианте осуществления изобретения,отрицательный контроль выполняется добавлением буфера, в частности, физиологически приемлемого буфера, такого как(солевой раствор,забуференный фосфатом) 0,9 или 5 глюкоза, к антиген-специфической клетке, которая присутствует в цельной крови второго образца,который является аутентичным с указанным первым образцом (аутентичный с означает полученный из того же источника, что и). В другом варианте осуществления изобретения,положительный контроль может быть выполнен добавлениемк антиген-специфической Тклетке, которая присутствует в цельной крови третьего образца, который является аутентичным с указанным первым образцом. В одном варианте осуществления, контроль вакцинацией, в частности, контроль вакцинацией БЦЖ, может осуществляться добавлением -6(белка фильтрата культуры) к антигенспецифической Т-клетке, которая присутствует в цельной крови четвертого образца, который является аутентичным с указанным первым образцом. Альтернативно, контроль того, имел или не имел место контакт с нетуберкулезными бактериями у донора цельной крови, может осуществляться добавлением(белка фильтрата культуры) к антигенспецифической Т-клетке, которая присутствует в цельной крови четвертого образца, который является аутентичным с указанным первым образцом. 4 В другом варианте осуществления, контроль вакцинации может иметь место добавлением антигена вакцинации к антиген-специфической Тклетке, которая присутствует в цельной крови пятого образца, который является аутентичным с указанным первым образцом. В еще одном варианте осуществления способа в соответствии с изобретением, ингибитор секреции выбран из группы, состоящей из брефелдина А,моненсина или тому подобных. В соответствии с изобретением, определение цитокинового профиля осуществляется посредством подходящих способов, таких как проточная цитометрия. Способ в соответствии с изобретением может применяться к образцам цельной крови, полученных у людей или животных. Способ в соответствии с изобретением в частности применяется для прослеживания контакта, причем цельную кровь получают у индивида, находящегося в близком контакте с пациентом с активным ТВ, или с подозрением на наличие в прошлом контакта с пациентом с активным ТВ. Кроме того, в зависимости от результата диагностического анализа по изобретению, решение по лечению или схема устанавливается следующим образом а. профилактика, такая как(изониазид), или активное лечение, такое как терапия четырьмя препаратами, показано в случаях, когда был выявлен сдвиг цитокинового профиля в сторону Тклеток,секретирующих только-,сопровождающийся уменьшением содержания Тклеток, секретирующих и -, и -2 1. если диагностические исследования выявили латентную инфекциюТклетками, секретирующими и -, и -2, и нет информации о предыдущем тестировании, то срочная терапия не требуется, и пациента следует повторно тестировать в пределах 2-4 недель 2. если диагностические исследования выявили латентную инфекциюТклетками, секретирующими и -, и -2, и если при предыдущем тестировании на латентную инфекциюпока не выявлен контакт с,показана профилактика, такая как терапия 1. срочная терапия не показана, если у пациента не проявляется реакция с 2. в случае, если у пациента выявляются какиелибо клинические симптомы, то показано повторное тестирование. Способ в соответствии с изобретением может,кроме того, использоваться для исследования цельной крови, которая была получена у индивида,перед получением иммуносуппрессивных лекарственных средств или при состоянии нарушенного иммунитета,подобном ВИЧинфекции. В зависимости от результата диагностического анализа по изобретению, решение о лечении или схеме устанавливается следующим образом а. профилактика, такая как , или активное лечение, такое как терапия четырьмя препаратами,и, необязательно, задержка иммуносуппрессивной терапии, показана в случаях, когда был выявлен сдвиг цитокинового профиля в сторону Т-клеток,секретирующих только - с сопровождающимся уменьшением содержания Т-клеток, секретирующих и -, и -2 1. если диагностические исследования выявили латентную инфекциюТклетками, секретирующими и -, и -2, и нет информации о предыдущем тестировании, то возможна иммуносуппрессивная терапия,и пациента следует повторно тестировать в пределах 2-4 недель 2. если диагностические исследования выявили латентную инфекциюТклетками, секретирующими и - и -2, и если при предыдущем тестировании на латентную инфекциюпока не выявлен контакт с, то показана профилактика, такая как терапия , а также повторное тестирование пациента в пределах 2-4 недель 1. иммуносуппрессивную терапию следует начинать, если у пациента не проявляется реакция с 2. в случае, если у пациента выявляются какиелибо клинические симптомы, то показано повторное тестирование. Способ в соответствии с изобретением может,кроме того, использоваться для исследования цельной крови, которая была получена у индивида с подозрением на активную ТВ инфекцию. В зависимости от результата диагностического анализа по изобретению, решение о лечении или схеме устанавливается следующим образом а. активное лечение, такое как терапия четырьмя препаратами, показано в случаях, когда был выявлен сдвиг цитокинового профиля в сторону-положительных Т-клеток, сопровождающийся уменьшением содержания Т-клеток, секретирующих и -, и -2 1. если диагностические исследования выявили латентную инфекциюТклетками, секретирующими и -, и -2, и нет информации о предыдущем тестировании, то вероятность острой инфекции отсутствует, то следует рассматривать альтернативный диагноз, и пациента следует повторно тестировать в пределах 2-4 недель 2. если диагностические исследования выявили латентную инфекциюТклетками, секретирующими и -, и -2, и если при предыдущем тестировании на латентную инфекциюпока не выявлен контакт с, то показана профилактика, такая как терапия , или активное лечение, такое как терапия четырьмя препаратами, и пациента .следует повторно тестировать в пределах 2-4 недель 1. срочная терапия показана, если у пациента не проявляется реакция с 2. в случае, если у пациента выявляются какиелибо клинические симптомы, то показано повторное тестирование. На фиг.1 изображен цикл инфекции М.. На фиг.2 показан проточно-цитометрический анализ антиген-специфических Т-клеток, которые были идентифицированы просто анализом цитокина. Было обнаружено, что дифференцировка между активным туберкулезом (-ТВ) и успешно леченным туберкулезом (Т-ТВ) невозможна одним анализом - независимо от стимуляции ,-6 или -10. Только -6 и -10 позволяют дифференцировать пациентов, имевших контакт с М.(-6 и/или -10 положительных), и пациентов с реакцией на вакцинацию чистой БЦЖ (-6 и - 10 отрицательных, не показано). На фиг.3 показана частота распределения специфических Т-клеток у пациентов с активньм туберкулезом (-ТВ) и индивидов с успешно леченным туберкулезом(Т-ТВ). Т-клетки идентифицировали активацией посредством 69 и специфической индукцией - использованием. Было обнаружено, что хотя у пациентов с ТВ имеются значимо более высокие частоты специфических Т- клеток, дифференцировка между активным туберкулезом (-ТВ) и успешно леченным туберкулезом(Т-ТВ) невозможна изолированным анализом - в отдельном случае вследствие большого перекрытия. На фиг.4 иллюстративно показаны -/-2 цитокиновые профили - реактивных Т-клеток у четырех пациентов с успешно леченным туберкулезом. Процентная доля Т-клеток,секретирующих только -, секретирующих и-, и -2, и секретирующих только -2,количественно определяется на чертеже с левой стороны. Преобладающая пропорция клеток экспрессирует оба цитокина. На фиг.5 иллюстративно показаны -/-2 цитокиновые профили - реактивных Т-клеток у четырех пациентов с активным туберкулезом. Процентная доля Т- клеток, секретирующих только-2,количественно определяется на чертеже с правой стороны. У пациентов с активным туберкулезом проявляется сдвиг цитокинового профиля в сторону Т-клеток,секретирующих только -, сопровождающийся уменьшением количества Т-клеток, секретирующих и -, и -2. На фиг.6 показано обобщенное представление цитокиновых профилей у пациентов с активным туберкулезом (-ТВ) и успешно леченным туберкулезом(Т-ТВ). Пунктирная линия представляет предел-/-2-двойных положительных Т-клеток (56), ниже которого активный туберкулез может быть диагностирован со специфичностью 100 и чувствительностью 70. Этот предел был установлен посредством анализа рабочих характеристик приемного устройства Изобретение далее объясняется следующими примерами. Преимущественно, в способе в соответствии с изобретением продукция антигенспецифической клеткой определяется внутриклеточно. Таким образом, время стимуляции антиген-специфических Т-клеток туберкулезными антигенами(очищенным белковым производным), -6 (рано секретируемой антигенной мишенью), -10 (белком фильтрата культуры) может быть сокращено до 6 часов, в отличие от 20 часов предшествующих тестов(фиг.2). Хотя определение экспрессирующих -реактивных Т-клеток уже происходит со статистически значимой более высокой частотой у пациентов с активным туберкулезом, по сравнению с пациентами с латентным или успешно леченным туберкулезом, дифференцировка между этими двумя стадиями заболевания невозможна для отдельного пациента ввиду очень большого диапазона перекрытия (фиг.3). -6 и -10 просто обеспечивают возможность различения пациентов, имевших контакт с М.(-6- или -10- положительных) и пациентов с реакцией на вакцинацию чистой БЦЖ (-6 и-10-отрицательных, не показано). Однако возможность дифференцировки между активным и латентным или успешно леченным туберкулезом обеспечивается посредством активации через 69-специфических Т-клеток и одновременным определением - и интерлейкина-2 (-2). Хотя преобладающая фракция -реактивных Т-клеток экспрессирует и -, и -2 при латентном и успешно леченном туберкулезе(фиг. 4),цитокиновый профиль сдвигается в сторону клеток,секретирующих только -, при, активном туберкулезе (фиг.5). Посредством анализа рабочих характеристик приемного устройства ,устанавливается предел -реактивных Т-клеток,секретирующих и -, и -2, ниже которого активный туберкулез может быть диагностирован со специфичностью 100. В другом варианте осуществления популяции, этот предел составляет 56 Т-клеток, секретирующих и -, и -2, и посредством этого, можно отличить пациентов с активным туберкулезом (-ТВ) от пациентов с успешно леченным туберкулезом (Т-ТВ) с чувствительностью 70 (фиг.6). В другом варианте осуществления, определение цитокинового профиля осуществляется посредством проточной цитометрии меченными антителами. Так,в дополнение к определению -, также возможно одновременное количественное определение других функционально релевантных поверхностных молекул, таких как -1 (запрограммированная смерть клетки-1),-4(хемокиновый (С-Х-С мотив) лиганд 10). Для анализа антиген-специфических 4 Тклеток посредством проточной цитометрии,6 специфические Т-клетки возбуждаются антигенной стимуляцией до активации и продукции цитокина, и число возбужденных клеток в последующем выявляется посредством специфических антител. Для исследования-10. Для дифференцировки активного туберкулеза от латентного/успешно леченного туберкулеза,выполняют тест с , а для дифференцировки латентной/успешно леченной туберкулезной инфекции от предшествующей вакцинации,выполняют тест с -6 и -10.служит в качестве отрицательного контроля, которым могут быть установлены фоновые сигналы, такие как неспецифически реагирующие Т-клетки.служит в качестве положительного контроля. Стимуляция может выполняться непосредственно из цельной крови. Сначала, кровь смешивают с 28- и СБ 49-специфическими антителами, каждым в концентрации 1 мкг/мл, и смешивают с соответствующими антигенами ( 7,32 мкг/мл, туберкулин -50, , ). Стимуляции выполняли происходящими из М 6 пептидными пулами, охватывающими -6 и -10. Пептидные пулы -10 и -6 составлены из 15-мер, перекрывающихся 11 аминокислотами, и все пептиды были очищены ВЭЖХ чистота 80,.2011 17 372-376. После 2-часового периода инкубации (37 С, 6 СО 2),экзоцитоз цитокинов,вызванный стимуляцией, прекращается добавлением 10 мкг/мл брефелдинадля внутриклеточного накопления цитокинов. За этим следует еще 4 часовая инкубация (37 С, 6 С 2) . Стимуляция прерывается через 6 часов, и клетки фиксируют. Сначала к каждому образцу добавляют 2 мМ(этилендиаминтетрауксусной кислоты) с последующим смешиванием в течение 10 секунд и инкубацией при комнатной температуре в течение 15 минут. Фиксацию лейкоцитов и лизис эритроцитов осуществляли 9 мл лизирующего растворана 1 мл цельной крови в течение периода инкубации 10 минут при комнатной температуре. После центрифугирования и отсасывания супернатанта, клеточный осадок после центрифугирования промывали 2 мл буфера(-5 -0,5 -0,07 3). Это осуществляли добавлением буферас последующим центрифугированием и отсасыванием супернатанта. Наконец, фиксированные клетки собирали в буфер . После этого клетки могли непосредственно окрашиваться или храниться в холодильнике при 4 С в течение ночи. Для окрашивания стимулированных клеток специфическими меченными флуорохромом антителами, клетки перераспределяли в пробирки(сортировщика флуоресцентно активированных клеток). Лейкоциты из примерно 225-300 мкл цельной крови использовали на окрашивающую смесь. Сначала 2 мл сапонинового буфера ( буфер/0,1 сапонин) добавляли на каждый образец в течение 10 мин. После центрифугирования и отсасываниябуфера,добавление смеси антител осуществляли в общем объеме 50 мкл каждая на образецбуфера/0,1 сапонина (анти-С 4 клон 3, анти клон 4. ВЗ, анти 2 клон 1-1712 и анти- 69 клон 78). Поскольку антитела чувствительны к свету,30-минутную инкубацию проводили в темноте при комнатной температуре. В последующем, клетки промывали 3 млбуфером для удаления несвязанных антител. Наконец, клеточный осадок после центрифугирования собирали в 150 мкл 1 раствора параформальдегида и анализировали посредством проточной цитометрии. При успешно леченном туберкулезе, было обнаружено, что преобладающая фракция антигенспецифических Т-клеток экспрессирует и -, и-2 после специфической стимуляции . К удивлению, когда существует активный туберкулез,цитокиновый профиль сдвигается в сторону Тклеток, секретирующих только -, что сопровождается одновременным уменьшением содержания Т-клеток, секретирующих и -, и-2. Латентная или успешно леченная туберкулезная инфекция может дифференцироваться от реакции на вакцинацию стимуляцией -6 и -10. -6 и -10 обеспечивают возможность различения пациентов,имевших контакт с М.(-6 и/или-10-положительных) и пациентов с реакцией на вакцинацию чистой БЦЖ (-6- и -10 отрицательных). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ - для быстрого определения статуса инфекциипо цельной крови с точки зрения активного или латентного туберкулеза, включающий стадии стимуляции антиген-специфической Т-клетки,которая присутствует в первом образце цельной крови, очищенным белковым производнымв присутствии антител против 28, или 28 и 49- обработкиантиген-представляющими клетками (АРС) путем инкубации в течение от 1,5 ч до 2,5 ч, особенно, в течение 2 ч, при температуре от 35 С до 39 С, особенно, при 37 С, необязательно с добавлением С 2- затем добавления ингибитора секреции- осуществления интенсивного смешивания и- другой инкубации в течение периода по меньшей мере 2,5 ч при температуре от 35 С до 39 С, и- определения цитокинового профиля и по продукции внутриклеточного -, и продукции внутриклеточного -2 антиген-специфической Тклетки причем на присутствие активного туберкулеза указывает сдвиг цитокинового профиля в сторону Т-клеток, секретирующих только сопровождающийся уменьшением содержания Тклеток, секретирующих и -, и -2. 2. Способ по п.1, где другую стимуляцию ,-6 и -10 и/или антигеном вакцинации осуществляют в дополнение к указанной стимуляции . 3. Способ по п.1 или 2, где отрицательный контроль выполняется добавлением физиологического буфера, такого как 0,9 или 5 глюкоза, к антиген- специфической Тклетке, которая присутствует в цельной крови второго образца, который является аутентичным с указанным первым образцом. 4. Способ по любому из п.п.1-3, где положительный контроль выполняется добавлениемк антиген-специфической Т-клетке, которая присутствует в цельной крови третьего образца,который является аутентичным с указанным первым образцом. 5. Способ по любому из п.п.1-4, где контроль вакцинацией осуществляется добавлением антигена вакцинации к антиген-специфической Т-клетке,которая присутствует в цельной крови четвертого образца, который является аутентичным с указанным первым образцом. 6. Способ по любому из п.п. 1-5, где контроль вакцинацией БЦЖ осуществлятся добавлением-10 (белка фильтрата культуры) к антигенспецифической Т-клетке, которая присутствует в цельной крови четвертого образца, который является аутентичным с указанным первым образцом. 7. Способ по любому из п.п.1-6, где контроль того, имел ли место контакт с нетуберкулезными микобактериями у донора цельной крови,осуществляется добавлением(белка фильтрата культуры) к антигенспецифической Т-клетке, которая присутствует в цельной крови пятого образца, который является аутентичным с указанным первым образцом. 8. Способ по любому из п.п.1-7, где ингибитор секреции выбран из группы, состоящей из брефелдина А, моненсина или тому подобных. 9. Способ по любому из п.п.1-8, где определение цитокинового профиля осуществляется посредством проточной цитометрии. 10. Способ по любому из п.п.1-9, где цельная кровь образцов получена у людей или животных. 11. Способ по любому из п.п.1-10, применяемый для прослеживания контакта, причем цельную кровь получают у индивида, находящегося в близком контакте с пациентом с активным ТВ, или с подозрением на наличие в прошлом контакта с пациентом с активным ТВ. 12. Способ по п.11, где решение по лечению принимается следующим образом а. профилактика, такая как , или активное лечение, такое как терапия четырьмя препаратами,показано в случаях, когда был выявлен сдвиг цитокинового профиля в сторону Т-клеток,секретирующих только -, сопровождающийся уменьшением содержания Т-клеток, секретирующих и -, и -2 7 1. если диагностические исследования выявили латентную инфекциюТклетками, секретирующими и -, и -2, и нет информации о предыдущем тестировании, то срочная терапия не требуется, и пациента следует повторно тестировать в пределах 2-4 недель 2. если диагностические исследования выявили латентную инфекциюТклетками, секретирующими и -, и -2, и если при предыдущем тестировании на латентную инфекциюпока не выявлен контакт с, то показана профилактика, такая как терапия 1. срочная терапия не показана, если у пациента не проявляется реакция с 2. в случае, если у пациента выявляются какиелибо клинические симптомы, показано повторное тестирование. 13. Способ по любому п.1-10, где цельная кровь была получена у индивида перед получением иммуносуппрессивных лекарственных средств или при состоянии нарушенного иммунитета, подобном ВИЧ-инфекции. 14. Способ по п.13, где решение по лечению принимается следующим образом а. профилактика, такая как , или активное лечение, такое как терапия четырьмя препаратами,и, необязательно, задержка иммуносуппрессивной терапии, показана в случаях, когда был выявлен сдвиг цитокинового профиля в сторону Т-клеток,секретирующих только -, сопровождающийся уменьшением содержания Т-клеток, секретирующих и -, и -2 1. если диагностические исследования выявили латентную инфекциюТклетками, секретирующими и -, и -2, и нет информации о предыдущем тестировании, то возможна иммуносуппрессивная терапия,и пациента следует повторно тестировать в пределах 2-4 недель 2. если диагностические исследования выявили латентную инфекциюТклетками, секретирующими и -, и -2, и если при предыдущем тестировании на латентную инфекциюпока не выявлен контакт с, то показана профилактика, такая как терапия , а также повторное тестирование пациента в пределах 2-4 недель 1. иммуносуппрессивную терапию следует начинать, если у пациента не проявляется реакция с 2. в случае, если у пациента выявляются какиелибо клинические симптомы, показано повторное тестирование. 15. Способ по любому п.1-10, где цельная кровь была получена у индивида с подозрением на активную ТВ инфекцию. 16. Способ по п.15, где решение по лечению принимается следующим образом а. активное лечение, такое как терапия четырьмя препаратами, показано в случаях, когда был выявлен сдвиг цитокинового профиля в сторону Тклеток,секретирующих только,сопровождающийся уменьшением содержания Тклеток, секретирующих и -, и -2 1. если диагностические исследования выявили латентную инфекциюТклетками, секретирующими и -, и -2, и нет информации о предыдущем тестировании, то вероятность острой инфекции отсутствует, то следует рассматривать альтернативный диагноз, и пациента следует повторно тестировать в пределах 2-4 недель 2. если диагностические исследования выявили латентную инфекциюТклетками, секретирующими и -, и -2, и если при предыдущем тестировании на латентную инфекциюпока не выявлен контакт с, то показана профилактика, такая как терапия , или активное лечение, такое как терапия четырьмя препаратами, и пациента следует повторно тестировать в пределах 2-4 недель. срочная терапия показана, если у пациента не проявляется реакция с 2. в случае, если у пациента выявляются какиелибо клинические симптомы, показано повторное тестирование.