Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L., – продуцент моноклональных антител к белковому антигену Mycobacterium tuberculosis

(51) 12 5/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Штамм гибридных культивируемых клеток продуцирующих моноклональные антитела к белковому антигену,получали гибридизацией иммунных лимфоцитов мыши линии / с клетками миеломной линии 638.653 по методу Келера и Мильштейна,(1976). Изучение иммунохимических свойств моноклональных антител проводили с использованием иммуноферментного анализа,иммуноблота и электрофореза в полиакриламидном геле. Штамм гибридных культивируемых клеток животных., -продуцирует однородный по составу гомогенные препараты антител, которые реагируют только с белковым антигеном. Концентрация антител - 25 мкг/мл в культуральной среде. Концентрация моноклональных антител по белку очищенных из асцитной жидкости - 4-8 мг/мл. Титр иммуноглобулинов в культуральной среде - 132, а в асцитной жидкости титр антител достигает - 112800. Все полученные моноклональные антитела относятся к классу , подклассу 1. Константа связывания (аффинность) моноклональных антител составляет 110 8 М-1.(72) Бакирова Гульнар Аманжоловна Ахаева Айжан Абдисадиковна Муканов Касым Касенович Шенжанов Канат Тюлебаевич Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ., - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К БЕЛКОВОМУ АНТИГЕНУ(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине при диагностике туберкулеза людей. 22178 Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине при диагностике туберкулеза людей. Известны ряд штаммов гибридом, продуцирующих моноклональные антитела (МКА) к цельным клеткам микобактерий туберкулеза бычьего вида. Авторами на основе моноклональных антител были разработаны тест-системы иммуноферментного анализа для идентификации, которые характеризовались специфичностью и не уступали в надежности биохимическим тестам (Андросова М.В. и соавт. Иммуноферментный анализ для идентификации микобактерий туберкулеза бычьего вида с помощью моноклональных антител//Ж. Проблемы туберкулеза. 1996, 2. с.40-43). МКА данной гибридомы не может использоваться в разработке способов диагностики туберкулеза людей, т.к. имеет родство к возбудителю туберкулеза бычьего вида. Известны штаммы гибридом, к двум видам атипичных микобактерийи. Моноклональные антитела в иммуноблотинге связывались только с антигенами,остальные 2 типа моноклональных антител давали перекрестные реакции, т.е. были направлены к общим эпитопам обоих видов микобактерий. Узкоспецифические моноклональные антитела, по мнению авторов,могут быть использованы для идентификации атипичных микобактерий, выделения антигенов узкой специфичности и дифференциальной серодиагностики (Куликовская Н.В. и соавт. Получение и характеристика моноклональных антител к микобактериями//Ж. Проблемы туберкулеза. 1996, 2. с. 43-46). Однако МКА гибридом описанных выше не могут быть использованы в разработке способов диагностики туберкулеза людей, так как имеют родство к атипичным микобактериям. Наиболее близки к изобретению аналог(прототип) штамм гибридомы В 3 Н 9 продуцирующий моноклональные антитела (МКА) к белковому антигенувида(Черноусова Л. Н.,Куликовская Н.И.,Разумовская И.С. Получение и характеристика моноклональных антител, реагирующих свида- Журнал проблемы туберкулеза, 1990,2. с.49-51). Мышей линии / иммунизировали 100 мкг соникатов 37 подкожно в 6 точек 2 раза с интервалом 2 недели. Тестирование и отбор позитивных гибридом осуществляли методом ИФА. Моноклональные антитела В 3 Н 9, согласно данным ИФА с моноспецифическими антисыворотками к различным классам иммуноглобулинов мыши ( , ,А), относится к классу. Полученные антитела направлены к антигенной детерминанте на антигене с молекулярной массой 20 кД. Предлагаемый нами штамм гибридных культивируемых клеток отличаются от аналогов той 2(эпитопной) специфичностью. Полученные нами МКА, как показал вестерн - блот анализ, идентифицирует антигенную детерминанту, которая локализуется на белке с молекулярной массой 66 кДа. Задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующего моноклональные антитела к белковому антигену. Штамм получают следующим образом. Мышам линии / в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг белкового антигена, в 0,1 мл полного адьюванта Фрейнда и 0,5 мл забуференном физиологическом растворе (ЗФР), рН 7,2-7,4. Смесь взбивают до образования творожистой массы. На 7, 11, 12, 13-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг антигена в ЗФР, рН 7,2-7,4. Спустя 3 дня после последней иммунизации спленоциты мышей,которые дают более высокие титры антител по ИФА используют для гибридизации. Гибридизацию проводят добавлением 1-го мл раствора,содержащего 45 полиэтиленгликоля 4000 и 10 диметилсульфоксид и 45 -1640 к смеси состоящего из 4106 клеток -63.-8-5.6.3. и 20106 спленоцитов в течение 1 минуты. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля их высевают в ячейки 96 луночной панели. На следующий день в эти лунки вносят среду с гипоксантином, аминоптерином и тимидином (ГАТТ). Через 10-14 дней после слияния в лунках, имеющих колонии клеток размером 23 мм,отбирают культуральную среду для определения продуктивности гибридных клеток. Тестирование проводят методом твердофазного ИФА с использованием белкового антигена и кроличьих иммуноглобулинов к антителам мыши, меченых пероксидазой хрена. В течение 21 дня после слияния, клетки находятся в среде ГАТТ. Затем постепенно клетки переводят на среду гипоксантинтимидин (ГТ) и полную среду -1640. Клоны клеток, продуцирующих моноклональные антитела,трижды клонируют методом лимитирующих разведений. После третьего клонирования 60 субклонов продуцируют антитела к тестируемому антигену. Штамм гибридных клеток продуцирует антитела в культуральную среду. Продуктивный клон гибридомы обозначают 1 Д 7. Штамм гибридных клеток 1 Д 7 депонирован и хранится в ДТП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан (010000, г. Астана, ул. Ш.Валиханова, 43) под регистрационным номером- 0215 и характеризуется следующими свойствами. Морфологическая характеристика. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. 22178 Культуральные свойства. Гибридные клетки выращивают в среде -1640, содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-20) 20 мл/л 200 мМ глютамина- 3,375 г/л 2-меркаптоэтанола 3 мкл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия - 3,7 г/л. Клетки культивируют при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация 2 х 105 клеток в 1 мл. Частота пассирования через 3-4 суток. При внутрибрюшинном введении сингенным мышам штамм гибридомы образует опухоль в асцитной форме на 14 - 16 день. Доза клеток при прививке 2105 клеток. За 14 дней до введения гибридомы мышам вводят внутрибрюшинно 2,6,10,14 тетраметилпентадекан в дозе 0,5 мл на голову. Штамм сохраняет способность продуцировать специфические моноклональные антитела в течение 4 пассажей на сингенных мышах (время наблюдения). Продуктивность штамма. На 8 день культивирования гибридомы, концентрация антител достигает 25 мкг/ мл в культуральной среде. Концентрация моноклональных антител по белку очищенных из асцитной жидкости составляет 48 мг/мл. Титр иммуноглобулинов в культуральной среде 132, а в асцитной жидкости титр антител достигает до 112 800. Характеристика полезного продукта. Синтезируемые штаммом гибридомы моноклональные антитела относятся к классу , подклассу 1. Константа связывания(аффинность) моноклональных антител по отношению к белкусоставляет 110 8 М-1. Методы оценки специфичности МКА иммуноблотинг, непрямой и сэндвич варианты ИФА. Контаминация. Контаминантов в клетках включая,бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружено. Криоконсервация. К осадку гибридных клеток добавляют эмбриональную сыворотку коров, и затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10. Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимися крышками по 2105 клеток в объеме 1 мл. Ампулы помещают в коробку из пенопласта и оставляют на сутки при -70 С,а затем переносят в жидкий азот. Условия размораживания. Замороженную ампулу быстро помещают в водяную баню при 37 С. После размораживания суспензию клеток переносят стерильно в пробирку, содержащую 10 мл холодной бессывороточной среды -1640,отмывают один раз и засевают в ячейки 24 луночной планшеты с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 60. Штамм гибридных культивируемых клеток 1 Д 7 используют следующим образом. Пример 1. Гибридные клетки высевают в пластиковые матрасы площадью по клеток в мл питательной среды и инкубируют 3 дня при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Суспензию клеток с культуральной средой собирают и центрифугируют 10 минут при 800 с целью отделения клеток от надосадочной жидкости, содержащей антитела. При культивировании гибридомы на мышах,иммуноглобулины из асцитной жидкости получают методом высаливания сульфатом аммония до 50 насыщения. Для этого в асцитную жидкость добавляют равный объем 0,15 М фосфатнобуферного раствора (ФБР), рН-7,2. Затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата,аммония и оставляют при перемешивании на ночь при 4 С. Иммуноглобулины отделяются центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 30 минут,при 4 С. Осадок антител ресуспендируют в минимальном объеме ФБР. Пример 2. Для проведения непрямого ИФА на 96-луночную планшету для иммунологических реакций сорбируют раститрованные белковый антиген. Раститровку проводят с 10 мкг/мл до 1 нг/мл и вносят по 100 мкл в лунку в 0,05 М трис , рН 7,2-7,4. Планшет инкубируют при 4 С в течение ночи. Затем планшет отмывают 3 раза в 0,005 М трис , рН 7,2-7,4 с 0,05-ным твином-20 и 3 раза в 0,005 М трис ,рН 7,2-7,4. В лунки планшеты вносят по 100 мкл 10 раствора фетальной сыворотки телят для забивки свободной поверхности лунки и инкубируют в течение 1 часа при 37 С. После инкубирования повторяют процедуру отмывки. На раститрованный антиген вносят разведения моноклональных антител с 1100 до 16000 в объеме 100 мкл в 0,05 М трис , содержащий 10 фетальной сыворотки телят и 0,05 Твин-20. После инкубации в течение 1 часа при 37 С планшету отмывают описанным способом и вносят в ячейки антитела кролика против иммуноглобулинов мыши,меченные пероксидазой. Через 1 ч повторяют процедуру отмывки с целью удаления несвязанных продуктов реакции. Антитела против белкового антигенаопределяют количественно по расщеплению субстрата, который готовят разведением 10 мг ортофенилендиамина в 10 мл лимонной кислоты, РН - 4,5 с добавлением 50 мкл 3 раствора перекиси водорода. Положительная реакция характеризуется коричневым окрашиванием и просчитывается при 492 нм. Результаты опыта по определению специифичности МКА в непрямом варианте ИФА представлены в таблице 1. 22178 Таблица 1 Изучение специфичности и активности МКА штамма гибридом 1 Д 7 Ультразвуковые дезинтеграты микобактерий 1256 116 РО РО РО РО РО РО 1204800 16400 РО РО РО РО РО РО Как видно из таблицы 1, моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридомы 1 Д 7,взаимодействуют с белковым антигеном ультразвукового дезинтеграта и вступает в слабую перекрстную реакцию, с белковым антигеном ультразвукового дезинтеграта . 8. Пример 3. Образцы белкового антигенав количестве 10 мкг подвергают электрофорезу в 7-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Электрофореграмму переносят на нитроцеллюлозную мембрану в течение 2 часов при силе тока 60 В и 250 мА. Свободные участки носителя блокируют 1-ным бычьим сывороточным альбумином в ЗФР, рН 7,27,4 (18 ч при 4 С или 2 ч при 37 С), затем отмывают по 3 раза ЗФР и инкубируют 1,5 ч при 37 С с МКА из очищенной асцитной жидкости, разведенной 1100 ЗФР-Тв. После этого носитель отмывают 3 раза ЗФР-Тв и ЗФР, затем его выдерживают в рабочем разведении антимышиных антител,меченных пероксидазой (1 ч при 37 С). Повторяют процедуру отмывки и проявляют реакцию с помощью 4-хлор-1 -нафтола. Иммунохимическое проявление фракций белков в иммуноблотинге с применением моноклональных антител и антимышиных антител, меченных пероксидазой хрена, показало специфичность моноклональных антител к эпитопам белка,молекулярная масса которого соответствовала 66 кД. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гибридных культивируемых клеток животных. 1 Д 7, депонированный в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии МОН РК,0215, продуцирующий моноклональные антитела к белковому антигену