Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS L. – продуцент моноклональных антител к белковому антигену Trichophyton rubrum

(51) 12 5/12 (2006.01) 61 39/395 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ белковому антигену, получают гибридизацией иммунных лимфоцитов мыши линии/ с клетками миеломной линии 638.653 по методу Келера и Мильштейна (1976). Изучение иммунохимических свойств моноклональных антител проводят с использованием иммуноферментного анализа, иммуноблота и электрофореза в полиакриламидном геле. Штамм гибридных культивируемых клеток животных., - продуцирует однородный по составу гомогенный препарат антител, которые реагируют только с белковым антигеном. Концентрация антител - 40 мкг/мл в культуральной среде. Концентрация моноклональных антител (по белку), очищенных из асцитной жидкости - 4 мг/мл. Титр иммуноглобулинов в культуральной среде 132, а в асцитной жидкости титр антител достигает 112800. Все полученные моноклональные антитела относятся к классу , подклассу 1. Константа связывания моноклональных антител составляет 510-7 М.(72) Акимбаева Айнур Курманбековна Муканов Касым Касенович Кухар Елена Владимировна Сураншиев Жанболат Амреевич(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ. ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К БЕЛКОВОМУ АНТИГЕНУ(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине при диагностике дерматомикозов человека, вызванных, а также для индикации возбудителя болезни в объектах внешней среды и изучения таксономии микроорганизмов. Штамм гибридных культивируемых клеток,продуцирующих моноклональные антитела к 24303 Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине при диагностике дерматомикозов человека, вызванных, а также для индикации возбудителя болезни в объектах внешней среды и изучения таксономии микроорганизмов.- антропофильный гриб,являющийся возбудителем руброфитии (микоз гладкой кожи, гранулема Майокки, узелковый гранулематоз, микоз крупных складок тела, микоз стоп и кистей, онихомикоз) человека. Может поражать пушковые волосы, в которых элементы гриба располагаются как по типу эндотрикс, так и по типу эктотрикса (нео-эндотрикс), кожу, ногти.относится к несовершенным,митоспоровым грибам, классу дейтеромицетов. По характеру метаболизма,химическому составу клеточных стенок и по последовательности - эти грибы относят к эумицетам определенного класса - аскомицетам. (Р.А. Аравийский, Н.Н. Климко, Н.В. Васильева. Диагностика микозов. СПб. Изд. дом СПбМАПО,2006, - с.8-77. // К.И. Разнатовский, А.Н. Родионов,Л.П. Котрехова. Дерматомикозы. СПб. Изд. дом СПбМАПО, 2006, - с.9-18.). Антигенная структура дерматомицетов очень сложная и включает в себя растворимые углеводные структуры, представляющие собой детерминанты антигенов. К их числу относят структурнометаболические гликаны типа галактанов, глюканов,маннанов или их, ковалентно связанных с другими молекулами, комплексов. Полисахариды клеточной стенки грибов могут образовывать с белками и жировыми веществами растворимые и нерастворимые комплексы. У дерматофитов это гетерополисахариды,которые определяют специфичность видов грибов и их антигенное родство. Вариабельность полисахаридов,составляющих основу клеточной стенки грибов и состоящих из 5-6 моносахаров, меньшая, чем у белков, составляющих основу клеточной стенки бактерий и имеющих в своем составе 20-22 аминокислоты. Этим определяется антигенное родство между далекими по своим морфологическим признакам видов микробов, что затрудняет серологическую диагностику дерматомикозов. (Лещенко В.М. Лабораторная диагностика грибковых заболеваний. Москва. Медицина, 1982, с.5-23, 56-61, 142). Кроме того, антигены, происходящие из различных дерматофитов, являются антигенными смесями. Эти антигены содержат общий для различных дерматофитов и всегда выявляемый групповой антиген - гифомицетовый антиген Н характерные для отдельных дерматофитов видоспецифические неполные антигены - , , К, С,антигены А и В, не обладающие видовой специфичностью и происходящие из питательной среды культуральные антигены. (Фейер Э. и др. Медицинская микология. Изд. АН Венгрии. Будапешт, 1966, с.15-868). В настоящее время микологический анализ включает микроскопию материала,2 люминесцентную диагностику,посев на питательные среды и идентификацию полученных изолятов грибов. Классические способы,используемые в диагностике дерматомикозов,характеризуются трудоемкостью, длительностью анализов,низкой чувствительностью и специфичностью. В связи с этим проблема поиска и разработки новых уникальных способов диагностики руброфитии, отличающиеся высокой точностью и эффективностью, остается одной из актуальных задач современной науки и практики. Известно, что МКА обладают высокой специфичностью и активностью. Это связано с тем,что гибридомная техника производства моноклональных антител позволяет получать гомогенные препараты иммуноглобулинов,специфически взаимодействующие только с определенной антигенной детерминантой патогенного агента. Это говорит о том, что МКА можно использовать при разработке высокочувствительных тест-систем, таких как способов иммуноферментного анализа (ИФА). Известен ряд штаммов гибридом,продуцирующих МКА к возбудителям зоонозных дерматомикозов. Известны гибридные клетки, полученные слиянием клеток мышиной миеломы и иммунными спленоцитами к различным антигенам.// . . 46,. 4, . 1995, р.435-444.). Известны штаммы гибридом, продуцирующие МКА к антигенам полисахаридной комплексной природы гриба. (Получение штаммов гибридных культивируемых клеток,синтезирующих моноклональные антитела к// Материалы Межд. науч.практ. конференции, посвящ. 50-летию основания АО Казахского агротехнического университета им. С.Сейфуллина,т.1. Астана,КАТУ им. С.Сейфуллина, 2007, с.108-109.). Известны штаммы гибридом, продуцирующие моноклональные антитела к,которые были получены от крысы,иммунизированной осадком этанольного фильтрата Т. . Гибридомы продуцировали 5 клонов МКА, которые являлись иммуноглобулинами класса М и специфически реагировали с препаратами экзоантигена с Т. . (, ., , . ..,//,.53. - . 1991. - р.181-193.). МКА,продуцируемые данными штаммами гибридных клеток, получены к полисахаридному антигену, в частности, к экзо-полисахаридам Т., что коренным образом отличается от предлагаемого изобретения, где полученный штамм гибридных клеток разработан с использованием мышей линии / и продуцирует МКА к белковому антигену Т. . Предлагаемый штамм гибридных клеток продуцирует МКА к белковому антигену, 24303 являющиеся иммуноглобулинами классас достаточно высокой активностью в ИФА. Это дает возможность использовать МКА для разработки экспресс - методов диагностики руброфитии, в частности, онихомикозов. Задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток,продуцирующего моноклональные антитела к белковому антигену. Штамм получают следующим образом. Мышам линии / в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг поверхностного белка клеточной стенкив 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда, на седьмой день - 100 мкг антигена в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда. На 11, 12, 13 дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг антигена в 0,1 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР),рН 7,2-7,4. Спустя 4 дня после последней иммунизации извлекают селезенку из тех мышей,которые дают более высокие титры антител по ИФА. Лимфоциты селезенки иммунных мышей в количестве 16 х 104 сливают с клетками миеломы 63-8-563 в присутствии 1 мл раствора,содержащего 45(объем на объем) полиэтиленгликоля 4000 и 10 диметилсульфоксида в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля их высевают в ячейки 96 луночной панели. На следующий день в эти лунки вносят среду с гипоксантином, аминоптерином и тимидином (ГАТ). Через 10-14 дней после слияния в лунках, имеющих колонии клеток размером 2-3 мм,отбирают культуральную среду для определения продуктивности гибридных клеток. Тестирование проводят методом ИФА с использованием белкового антигенаи кроличьих иммуноглобулинов к антителам мыши,меченых пероксидазой хрена. В течение 21 дня после слияния, клетки находятся в среде ГАТ. Затем постепенно клетки переводят на среду гипоксантинтимидин (ГТ) и полную среду -1640. Клоны клеток, продуцирующих моноклональные антитела,дважды клонируют методом лимитирующих разведений. После второго клонирования 100 субклонов продуцируют антитела к тестируемому антигену. Штамм гибридных клеток продуцирует антитела в культуральную среду. Продуктивный клон гибридомы обозначают / 1 - 3 С 10. Штамм гибридных клеток / 1 - 310 депонирован и хранится в Республиканской коллекции микроорганизмов РГКП Национальный центр по биотехнологии Республики Казахстан(473000, г. Астана, ул. Ш. Валиханова, 43) под регистрационным номером - 0223 и характеризуется следующими свойствами Морфологическая характеристика. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные свойства. Гибридные клетки выращивают в среде -1640, содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-20) 20 мл/л 200 мМ -глютамина- 3,375 г/л 2-меркаптоэтанола- 3 мкл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия - 3,7 г/л. Клетки культивируют при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация 2106 клеток в 1 мл. Частота пассирования через 3-4 суток. Продуктивность штамма. На 3-4-й день культивирования гибридомы секреция МКА достигает 40 мкг/мл в культуральной среде. Титры иммуноглобулинов в культуральной среде 132. Все указанные в данном пункте характеристики штамма клеток определяют методом ИФА. Характеристика полезного продукта. Моноклональные тела относятся к иммуноглобулинам класса , подкласса 1 Константа связывания 510-7 М. МКА к дерматомицету Т.специфически реагируют с белками с молекулярной массой 45 кДа. Методы оценки специфичности МКА непрямой и сэндвич варианты ИФА и реакция микроагглютинации (РМА). Контаминация штамма. Контаминантов в клетках, включая, бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы, не обнаружено. Криоконсервация. К осадку гибридных клеток добавляют эмбриональную сыворотку коров, и затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10. Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимися крышками по 2105 клеток в объеме 1 мл. Ампулы помещают в коробку из пенопласта и оставляют на сутки при -70 С, а затем переносят в жидкий азот. Условия размораживания. Замороженную ампулу быстро помещают в водяную баню при 37 С. После размораживания суспензию клеток переносят стерильно в пробирку, содержащую 10 мл холодной безсывороточной среды -1640,отмывают один раз и засевают в ячейки 24 луночной планшеты с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 65-70. Штамм гибридных культивируемых клеток/ 1 - 3 С 10 используют следующим образом. Пример 1. Гибридные клетки высевают в пластиковые матрасы объемом 25 мл по 3,2107 клеток в 1 мл питательной среды и инкубируют 3 дня при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Суспензию клеток с культуральной средой собирают и центрифугируют 10 минут при 800 с целью отделения клеток от надосадочной жидкости,содержащей антитела. При культивировании гибридомы на мышах,иммуноглобулины из асцитной жидкости получают методом высаливания сульфатом аммония до 50 насыщения. Для этого в асцитную жидкость добавляют равный объем 0,15 М фосфатнобуферного раствора (ФБР), рН - 7,2. Затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при перемешивании 3 24303 на ночь при 4 С. Иммуноглобулины отделяются центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 30 минут, при 4 С. Осадок антител ресуспендируют в минимальном объеме ЗФР. Пример 2. Для определения молекулярной массы структурного белка дерматофита, к которому получены МКА, проводят электрофорез и перенос белка на нитроцеллюлозную мембрану с последующим иммунохимическим проявлением(иммуноблотинг). Электрофорез белка проводят в 10 полиакриламидном геле в присутствии 0,1 додецилсульфата натрия. Перенос белка на нитроцеллюлозную мембрану проводят методом полусухого электроблотинга в аппарате фирмыпри силе тока 20 А в течение 3 часов. Нитроцеллюлозную мембрану используют для иммунохимического проявления антителами. Для этого нитроцеллюлозную мембрану инкубируют в растворе очищенного препарата моноклональных антител в разведении 1100 в течение 1 часа. После этого носитель инкубируют в течение 1 часа при 37 С с антителами кролика против иммуноглобулинов мыши, коньюгированных с пероксидазой хрена. Реакция проявляется субстратом, который готовят разведением 8 мг 4 хлор-1-нафтол в 1 мл этанола и добавлением 9 мл ЗФР и 50 мкл 3 раствора перекиси водорода. Результат Иммуноблотинг показал,что моноклональные антитела специфически связывают белки, имеющие молекулярную массу 45 000 дальтон. Пример 3. Определение константы связывания моноклональных антител. Для установления константы связывания иммунологические планшеты в 3 рядах лунок сенсибилизировались антигеном в оптимальной концентрации и в 3 рядах ниже оптимальной. Затем на них раститровывали очищенные сульфатом аммония моноклональные антитела, начиная с 10 мкг/мл. после проявления реакции по полученным данным строили графики и определяли концентрацию антител, связывающих 50 антигена. Подставляем эти данные в формулу Ксв- 2 , где- концентрация иммуноглобулинов в нг/мл связывающих 50 антигена, иммобилизированного в концентрации 5 мкг/мл,- концентрация иммуноглобулинов в нг/мл,связывающих 50 При определении константы связывания моноклональных антител использовали непрямой вариант иммуноферментного анализа. Концентрация моноклональных антител,связывающих 50 антигена различна. Так,например, концентрация моноклональных антител к дерматомицету, связывающих 50 антигена составляет 600 и 300 нг. При этом линия 1 является кривой реакции моноклональных антител с оптимальной концентрацией антигена, а линия 2 кривой реакции моноклональных антител с концентрацией антигена ниже оптимальной. Одним из важных свойств моноклональных антител является аффинность,которая характеризует уровень сродства антитела к испытуемому антигену, т.е. степень совпадения(комплементарности) конфигураций активного центра антитела и антигенной детерминанты. Аффинность может быть количественно изменена с помощью определения константы связывания. Показатель константы связывания моноклональных антител составил 510-7 М, что свидетельствует о высокой степени совпадения конфигураций активного центра антитела и антигенной детерминанты. Пример 4. Для проведения непрямого ИФА на 96-луночную планшету для иммунологических реакций сорбируют антигеныи различных видов дерматомицетов по 10 мкг/мл в 100 мкл ЗФР, рН 7,2-7,4 при 4 С в течение ночи. Затем панель отмывают 3 раза ЗФР с 0,05-ным твином-20 (ЗФР-Тв), готовят в ячейках панели двукратные разведения культуральной жидкости,начиная 12 и выше и асцитной жидкости 1100 и выше в объеме 100 мкл ЗФР-Тв. После инкубации в течение 1,5 часа при 37 С планшет отмывают описанным способом и вносят в ячейки антитела кролика против иммуноглобулинов мыши,меченные пероксидазой. Через 1 час повторяют процедуру отмывки с целью удаления несвязанных продуктов реакции. Антитела против антигенаопределяют количественно по расщеплению субстрата Н 2 О 2 в присутствии хромогена - ортофенилендиамина. Положительная реакция характеризуется желто-коричневым окрашиванием и просчитывается при 492 нм. Результаты опыта по определению специфичности МКА в непрямом варианте ИФА представлены в таблице. Таблица Изучение специфичности и активности МКА штамма гибридомы / 1 - 3 С 10 Виды антигенов Обратные велечины титров моноклональных антител 3 С 10 В культуральной жидкости В асцитной жидкости Белковый антиген Т.132 112800 Белковый антиген Т.отрицательно отрицательно Полисахаридный антиген Т.отрицательно 1100 Белковый антиген Т.12 отрицательно Белковый антиген Т.12 отрицательно Примечание - Титры 12 в РМА и 1100 в ИФА являются показателями фона и не имеют диагностической ценности. 4 Как видно из таблицы, моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридомы 24303 антигенамии вступают в слабую перекрестную реакцию с антигенами других дерматомицетов, что свидетельствует об их специфичности к возбудителю рубромикоза. Полученные данные свидетельствуют о возможности использования МКА штамма гибридомы / 1 - 3 С 10 в качестве реагента при разработке иммуноферментных тест-систем,которые позволят значительно усовершенствовать методы лабораторной диагностики дерматомикозов человека, вызванных. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гибридных культивируемых клеток животных., / 1 - 310,депонированный в Республиканской коллекции микроорганизмов РГКП Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан,регистрационный номер - 0223 - продуцент моноклональных антител к белковому антигену.