Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS L. – продуцент моноклональных антител у полисахаридному антигену Trichophyton verrucosum

(51) 12 5/18 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ полисахаридному антигенуполучают гибридизацией иммунных лимфоцитов мыши линии / с клетками миеломной линии 638.653 по методу Келера и Мильштейна(1976) и используют как продуцент моноклональных антител к полисахаридному антигену. Изучение иммунохимических свойств моноклональных антител проводят с использованием реакции микроагглютинации,иммуноферментного анализа, иммуноблота и электрофореза в полиакриламидном геле. Штамм гибридных культивируемых клеток животных., - продуцирует однородный по составу гомогенный препарат антител,которые реагируют только с полисахаридным антигеном. Концентрация антител - 0,04 мг/мл в культуральной среде. Концентрация моноклональных антител (по белку), очищенных из асцитной жидкости 4 мг/мл. Титр иммуноглобулинов в культуральной среде - 1256, а в асцитной жидкости титр антител достигает 112800. МКА имеют выраженные агглютинирующие свойства. Все полученные моноклональные антитела относятся к классу . Константа связывания(аффинность) моноклональных антител составляет 1,2106 М-1.(72) Кухар Елена Владимировна Муканов Касым Касенович Бакирова Гульнар Аманжоловна Киян Владимир Сергеевич Сауленова Диана Жаксыбаевна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(56) Киян , Иммунохимическая характеристика моноклональных антител,полученных к белковому антигену гриба// Вестник ПГУ. Серия химико-бнологическая.3. Павлодар, 2008,с. 90-100(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ. ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ПОЛИСАХАРИДНОМУ АНТИГЕНУ(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии для диагностики трихофитии крупного рогатого скота,вызванной, и в медицине для диагностики зооантропонозной трихофитии, а также в микробиологии для индикации возбудителя болезни в объектах внешней среды и изучения таксономии микроорганизмов. Штамм гибридных культивируемых клеток продуцирующих моноклональные антитела к 22664 Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии для диагностики трихофитии крупного рогатого скота, а также в микробиологии для индикации возбудителя болезни в объектах внешней среды и изучения таксономии микроорганизмов. Возбудителем трихофитии крупного рогатого скота является дерматомицет. Антигенная структура дерматомицетов очень сложная и включает в себя растворимые углеводные структуры, представляющие собой детерминанты антигенов. К их числу относят структурно-метаболические гликаны типа галактанов, глюканов, маннанов или их, ковалентно связанных с другими молекулами, комплексов. Полисахариды клеточной стенки грибов образуют с белками и жировыми веществами растворимые и нерастворимые комплексы. У дерматофитов это гетерополисахариды,которые определяют специфичность видов грибов и их антигенное родство. Вариабельность полисахаридов,составляющих основу клеточной стенки грибов и состоящих из 5-6 моносахаров, меньшая, чем у белков, составляющих основу клеточной стенки бактерий и имеющих в своем составе 20-22 аминокислоты, что определяет антигенное родство между далекими по своим морфологическим признакам видов грибов и затрудняет серологическую диагностику дерматомикозов Лещенко В.М. Лабораторная диагностика грибковых заболеваний. Москва. Медицина. 1982. с. 5-23, 56-61, 142. / Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов. Москва. Наука. 1983. с. 5-54, 70-203./Елинов Н.П. Патогенные дрожжеподобные микроорганизмы. Москва. Медицина. 1964. с. 2025, 197-198, 275. Современная диагностика дерматомикозов основана на выяснении эпидемиологической и эпизоотической обстановки, на определении клинической картины болезни и на результатах лабораторных исследований. Классические методы,используемые в диагностике трихофитии характеризуются трудоемкостью и длительностью анализов,низкой чувствительностью и специфичностью. Лабораторная диагностика указанной группы заболеваний практически отсутствует,т.к. отсутствуют достаточно специфичные,чувствительные,удобные в обращении экспрессные тест-системы. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Грибковые инфекции. Руководство для врачей. 2. изд. М. Издательство БИНОМ, 2008. С. 35-71. Методы иммуноферментного анализа (ИФА) для диагностики дерматомикозов имеют большую перспективу, чем другие серологические реакции,т.к. здесь используются специфические для возбудителя антигены или антитела иммуноглобулины,направленные против уникальных эпитопов патогенов,характеризующиеся постоянными свойствами,продуцируемые одним определенным клоном, т.е. имеющие моноклональное происхождение и доступные в неограниченном количестве. 2 Моноклональные антитела (МКА) продуцируется гибридными культивируемыми клетками(гибридомами), получаемыми путем слияния иммунных лимфоцитов с миеломными клетками Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.Ф. и др. Клеточная инженерия. Биотехнология. Книга 3. М. Высшая школа, 1987. - с. 127-167 / Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител(гибридомная технология). Методы культивирования клеток. Л. Наука, 1987. - с. 194205. Известны штаммы гибридных клеток с авторским названием-1,синтезирующие моноклональные антитела против фосфорилхолинового компонента антигена, полученные слиянием клеток миеломы -8 со спленоцитами мышей линии/,иммунизированных цитоплазматическим антигеном. Полученные МКА относились к классу .,//. 1987, . 133, 9,. 2689-2698. Известен штамм гибридных культивируемых клеток с авторским названием 3 С 10, полученный слиянием клеток мышиной миеломы и иммунных спленоцитов к белковому антигену, который стабильно синтезирует МКА,принадлежащие к иммуноглобулинам класса ,характеризующиеся показателем константы связывания равным 510-7 М. Акимбаева А.К.,Кухар Е.В., Сураншиев Ж.А., Акибеков О.С. Иммунохимическая характеристика моноклональных антител,полученных к возбудителю рубромикоза., 2008. - . 15-20. Наиболее близким техническим решением по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту (прототипом) является штамм гибридных культивируемых клеток с авторским названием Ма/Т 3 - 2 ЕЗ, полученный слиянием клеток мышиной миеломы и иммунных спленоцитов к белковому антигену, который стабильно синтезирует МКА,принадлежащие к иммуноглобулинам класса М,характеризующиеся показателем константы связывания равным 3,310-8 М Киян , Кухар Е.В. Иммунохимическая характеристика моноклональных антител, полученных к белковому антигену гриба. // Вестник ПГУ. Серия химико-биологическая. 3. Павлодар,2008. - . 90-100. Штамм гибридных клеток Ма/Т 3 - 2 Е 3 продуцирует МКА к белковому антигену, которые предназначены для выявления специфических антител возбудителя трихофитии крупного рогатого скота в сыворотке крови животных, что коренным образом отличается 22664 от предлагаемого изобретения, где полученный штамм гибридных клеток / 3 - 1 С 7,синтезирует МКА к поверхностному полисахаридному комплексу клеточной стенки дерматомицета, которые могут использоваться для выявления специфических антител и антигенов возбудителя трихофитии у крупного рогатого скота и зоонозной инфильтративно-нагноительной трихофитии человека. Предлагаемый штамм гибридных клеток продуцирует МКА класса ,которые строго специфичны к поверхностному полисахаридному антигенуи обладают агглютинирующими свойствами. Эти показатели дают возможность использовать МКА данного штамма для разработки экспресс - методов диагностики трихофитии крупного рогатого скота на основе им-муноферментного анализа, реакции латексагглютинации и микроагглютинации. Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующего моноклональные антитела к полисахаридному антигену. Штамм получают следующим образом. Мышам линии / в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг полисахаридного антигена клеточной стенки, полученного по методу О. , К.(1967), в 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда. На 7 день после первой иммунизации вводят 100 мкг полисахаридного антигена, в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда. На 14, 15, 16-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг полисахаридного антигена в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), рН 7,2-7,4. Спустя 3 дня после последней иммунизации извлекают селезенку из тех мышей, которые дают более высокие титры антител по ИФА. Лимфоциты селезенки иммунных мышей в количестве 20106 сливают с клетками миеломы 63-8-563 в присутствии 1 мл раствора, содержащего 45(объем на объем) полиэтиленгликоля 4000 и 10 диметилсульфок-сид в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля их высевают в ячейки 96 луночной панели. На следующий день в эти лунки вносят среду с гипоксантином, аминоптерином и тимидином (Г). Через 10-14 дней после слияния в лунках, имеющих колонии клеток размером 2-3 мм,отбирают культуральную среду для определения продуктивности гибридных клеток. Тестирование проводят методом ИФА с использованием полисахаридного антигенаи кроличьих иммуноглобулинов к антителам мыши,меченых пероксидазой хрена. В течение 21 дня после слияния, клетки находятся в среде ГАТ. Затем постепенно клетки переводят на среду гипоксантинтимидин (ГТ) и полную среду -1640. Клоны клеток, продуцирующих моноклональные антитела,трижды клонируют методом лимитирующих разведений. После третьего клонирования 100 субклонов продуцируют антитела к тестируемому антигену. Штамм гибридных клеток продуцирует антитела в культуральную среду. Продуктивный клон гиб-ридомы обозначают / 3 - 1 С 7. Штамм гибридных клеток / 3 - 1 С 7 депонирован и хранится в Республиканской коллекции микроорганизмов РГКП Национальный центр по биотехнологии Республики Казахстан(010000, г. Астана, ул. Ш. Валиханова, 43) под регистрационным номером - 0225 и характеризуется следующими свойствами. Морфологическая характеристика. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные свойства. Гибридные клетки выращивают в среде -1640, содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-20) 20 мл/л 200 мМ глютамина- 3,375 г/л 2-меркаптоэтанола - 3 мкл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия- 3,7 г/л. Клетки культивируют при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация 2106 клеток в 1 мл, кратность рассева 12. Частота пассирования клеток - через 3-4 суток. Продуктивность штамма. На 3-4-й день культивирования гибридомы секреция МКА достигает по белку 40 мкг/мл в культуральной среде, в асцитной жидкости - 4 мг/мл. Титры иммуноглобулинов в культуральной среде 1256, в асцитной жидкости - 112800. Все указанные в данном пункте характеристики штамма клеток определяют методом ИФА. Характеристика полезного продукта. Моноклональные тела относятся к иммуноглобулинам класса. Константа связывания 1,2106 М-1. МКА имеют выраженные агглютинирующие свойства к полисахаридному антигену дерматомицета Т. специфически реагируют с поверхностными полисахаридно-белковыми комплексами с молекулярной массой 64 кДа. Методы оценки специфичности МКА реакция микроагглютинации,непрямой и сэндвич варианты ИФА. Контаминация штамма. Контаминантов в клетках, включая, бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружено. Криоконсервация. К осадку гибридных клеток добавляют эмбриональную сыворотку коров, и затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10. Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимися крышками по 2105 клеток в объеме 1 мл. Ампулы помещают в коробку из пенопласта и оставляют на сутки при -70 С, а затем переносят в жидкий азот. Условия размораживания. Замороженную ампулу быстро помещают в водяную баню при 37 С. После размораживания суспензию клеток переносят стерильно в пробирку, содержащую 10 мл холодной бессывороточной среды -1640,3 22664 отмывают один раз и засевают в ячейки 24 луночной планшеты с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 70. Штамм гибридных культивируемых клеток/ 3 - 1 С 7 используют следующим образом. Пример 1. Гибридные клетки высевают в пластиковые матрасы площадью 25 см 3 по 2106 клеток в 1 мл на питательные среды и инкубируют 3 дня при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Суспензию клеток с культуральной средой собирают и центрифугируют 10 минут при 1000 с целью отделения клеток от надосадочной жидкости,содержащей антитела. При культивировании гибридомы на мышах,иммуноглобулины из асцитной жидкости получают методом высаливания сульфатом аммония до 50 насыщения. Для этого в асцитную жидкость добавляют равный объем забуференного физиологического раствора (ЗФР), рН 7,2-7,4. Затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при перемешивании на ночь при 4 С. Иммуноглобулины отделяют центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 30 минут, при 4 С. Осадок антител ресуспендируют в минимальном объеме ЗФР. Пример 2. Для установления константы связывания иммунологические планшеты в 3 рядах лунок сенсибилизируют антигеном в оптимальной концентрации и в 3 рядах ниже оптимальной. Затем на них раститровывают очищенные сульфатом аммония моноклональные антитела, начиная с 10 мкг/мл. Для определения константы связывания МКА используют непрямой вариант ИФА. После проявления реакции по полученным данным строят графики и определяют концентрацию антител, связывающих 50 антигена. Расчет делают по формуле Ксв 1/4- 2 , где- концентрация иммуноглобулинов в нг/мл связывающих 50 антигена, иммобилизированного в концентрации 5 мкг/мл,-концентрация иммуноглобулинов в нг/мл, связывающих 50 антигена, иммобилизированного в концентрации 10 мкг/мл. Показатель константы связывания моноклональных антител,синтезируемых гибридомой / 3 - 1 С 7 составляет 1,2106 М-1,что свидетельствует о достаточно высокой степени совпадения конфигураций активного центра антитела и антигенной детерминанты. Пример 3. Агглютинирующие свойства моноклональных антител выявляют в реакции микроагглютинации (РМА). В круглодонные ячейки планшета для микротитрования вносят по 0,05 мл ЗФР (рН 7,2-7,4). Затем в первые ячейки каждого ряда добавляют по 0,05 мл исследуемого образца МКА в концентрации 10 мкг/мл и делают двукратные разведения. После этого в каждую лунку вносят по 0,005 мл корпускулярного антигена Т. , встряхивают планшет и помещают в термостат при 37 С. В качестве отрицательного контроля используют фетальную сыворотку плода коровы (ФС) и сыворотку новорожденных телят (СН), в качестве положительного - гипериммунную сыворотку крови крупного рогатого скота (ГИС). Учет реакции проводят визуально по общепринятой методике (в крестах), таблица 1. Таблица 1 Результаты тестирования моноклональных антител на наличие агглютинирующих свойств Антиген Корпускулярный антиген Т.К(контроль антигена - ЗФР) Результаты показывают, что МКА обладают выраженными агглютинирующими свойствами,образуя характерные конгломераты и хлопья с просветлением среды. МКА ГИС ФС СН 1256 1256 Пример 4. Специфичность МКА определяют в РМА с использованием различных корпускулярных антигенов гриба, грибаединого бруцеллезного антигена и туберкулина (таблица 3). Таблица 2 Результаты тестирования моноклональных антител в реакции микроагглютинации с различными антигенами Корпускулярные антигеныЕдиный бруцеллезный антиген для РА и РСК Туберкулин Показатели титров специфических антител 1256 12 РО 22664 Результаты показывают, что МКА обладают высокой активностью и специфичностью, выявляя антигены гриба Т.в РМА. Пример 5. Специфичность МКА определяют в ТИФА с использованием различных антигенов. Для характеристики МКА используют полисахаридные и белковые антигены Т. , белковые антигены других дерматомицетов родаи гриба, а также другие растворимые антигены. Для проведения ТИФА на 96-луночный полистироловый планшет сорбируют антигены в концентрации 10 мкг/мл в 100 мкл ЗФР, рН 7,2-7,4. Инкубируют при 4 С в течение ночи или 2 часа при 37 С. Затем планшет отмывают 3 раза ЗФР с 0,05 ным твином-20 (ЗФР-Тв) и 3 раза ЗФР. В лунках вертикальных рядов планшета готовят двукратные разведения МКА, начиная с разведения 1100 и выше в 0,1 мл ЗФР-Тв. Одновременно ставят контроли с культуральной жидкостью миеломных клеток (КЖМ) в тех же разведениях и с ЗФР-Тв. Затем планшет накрывают крышкой и инкубируют в термостате при 37 С в течение 1 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют, повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл рабочего разведения конъюгата мыши, меченные пероксидазой) в ЗФР-Тв. Через 1 час после инкубации при 37 С повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл свежеприготовленной субстратной смеси (5 мг ОФД растворяют в 10 мл 0,05 М цитратно-фосфатного буфера, рН 4,5 и добавляют 0,025 мл 3-ного перекиси водорода). Затем планшет накрывают крышкой и оставляют в темном месте при комнатной температуре. Через 10-15 мин экспозиции реакцию останавливают путем внесения в каждую лунку по 0,1 мл 2 М раствора 24. Результаты реакции учитывают на спектрофотометре путем измерения оптической плотности жидкости в каждой лунке при длине волны 492 нм. Положительная реакция характеризуется появлением в лунках темнокоричневого окрашивания,отрицательная содержимое лунок остается бесцветным или имеет светло-желтое окрашивание. Титром МКА считают их максимальное разведение, величина оптической плотности (ОП) в котором в 2 и более раза превосходит оптическую плотность в лунках с отрицательным контролем. Результаты опыта по определению специфичности МКА в ТИФА представлены в таблице 3. Таблица 3 Результаты тестирования моноклональных антител в реакции ТИФА с различными антигенами Результаты Титры ОП ОПпр/ОП МКА 1 Т.по О. , К.(1967) 112800 0,303 46,6 2 Т.п .. (1979) РО 0,089 13,7 3 Т.по .. (1979) РО 0,055 9,2 4.п .. (1979) РО 0,022 3,6 5 п .. (1979) РО 0,019 2,9 6 Вирус лейкоза КРС (Р-24) РО 0,008 1,2 7 Хламидийный антиген РО 0,018 2,8 8 КЖМ РО 0,025 3,8 9 ЗФР(среднее значение) РО 0,0065 Примечание - РО - реакция отрицательная. Следовательно,результаты опыта Как видно из приведенных в таблице 3 свидетельствуют о специфичности МКА гибрезультатов, полученные моноклональные антитела ридомы / 3 - 1 С 7 к полисахаридному антигену проявляют высокую активность к родственному, что позволит получать на антигену дерматомицета Т. , выявляя его их основе эффективные диагностические препараты в более высоких титрах, чем остальные антигены. для индикации и дифференциации возбудителя Так, значение показателя ОП полисахаридного трихофитии крупного рогатого скота. антигена в 3,4 раза выше, чем у белкового антигена этого же гриба, более чем 5-12 раз выше значений ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ ОП белковых антигенов других дерматомицетов родаи более чем в 16 раз выше Штамм гибридных культивируемых клеток значений ОП антигенов других микроорганизмов. животных., / 3 - 17,Таким образом, МКА проявляют в ТИФА высокую регистрационный номер С- 0225 - продуцент специфичность и не реагируют с другими видами моноклональных антител к полисахаридному микроорганизмов. антигену клеточной стенки. Верстка Косалиева Б.А. Корректор Мадеева П.А. 5