Способ получения соматических гибридных клеток картофеля

(51) 12 5/04 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ биотехнологии растений, генной инженерии и сельскому хозяйству. Задачей разработки способа получения соматических гибридных клеток картофеля слиянием суспензионных и мезофильных протопластов с применением 40-ного полиэтиленгликоля (ПЭГ) и глицин-ОН-буфера,приготовленного на основе культурального фильтрата (КФ) микроводоросли хлореллы, является повышение качественного и количественного выхода гибридных клеток. Поставленная задача решается тем, что получения соматических гибридов картофеля сливают суспензионные и мезофильные протопластов картофеля с применением 40-ного полиэтиленгликоля (ПЭГ) и глицинбуфера,приготовленный на основе культурального фильтрата(КФ) микроводоросли хлореллы,содержащего биологически активные вещества. Это обеспечивает высокий выход жизнеспособных гибридных клеток (27) и их деление, что является важным фактором для получения соматических гибридных растений картофеля.(72) Лесова Жаниха Туреевна Жардемали Женис Кадырович Мусалдинов Тулеген Ботпаевич(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОМАТИЧЕСКИХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК КАРТОФЕЛЯ(57) Способ получения соматических гибридных клеток картофеля слиянием суспензионных и мезофильных протопластов относится к области 22663 Способ получения соматических гибридных клеток картофеля с использованием суспензионных и мезофильных протопластов относится к области биотехнологии растений, генной инженерии и сельскому хозяйству. Известен способ получения соматических гибридных клеток картофеля с применением суспензионных или мезофильных протопластов. Для выделения протопластов используются следующие ферменты,-23,ив разных концентрациях. В качестве осмотиков - маннитол и глицерин. Для слияния протопластов широко используется полиэтиленгликоль (ПЭГ) в сочетании с высоким рН (9-11) и высокой концентрацией ионов Са 2 (50300 мМ). Под действием ПЭГ происходит дегидратация поверхности клеток, ведущая к слипанию мембран и образованию в них пор. Через эти поры содержимое клеток объединяется. После отмывки от ПЭГ протопласты вновь приобретают округлую форму и в дальнейшем регенерируют клеточную стенку. Недостатком данного способа является низкий выход жизнеспособных гибридных клеток растений,,,//. . 15 .2, 2008. Задачей разработки способа получения соматических гибридных клеток растений с использованием суспензионных и мезофильных протопластов является повышение качественного и количественного выхода гибридных клеток картофеля. Суспензионные протопласты представлены культурными формами растений, а мезофильные - дикими формами, которые являются донорами признаков устойчивости к экстремальным факторам внешней среды, кроме того, мезофильные протопласты выполняли роль маркера при слиянии. При соматической гибридизации хлоропласты мезофильных протопластов располагаются вокруг ядер суспензионных протопластов и вдоль цитоплазматических тяжей, что отчетливо видно под микроскопом и упрощает выявление гибридных клеток. Подсчет количества клеток в 1 мл протопластной культуры проводили в камере Горяева по формуле Ма х 1000 (формула 1) где М - число клеток в 1 мл суспензии, а среднее число клеток в квадрате сетки, -глубина камеры, мм 2, -площадь квадрата сетки, мм 2,1000 мм 3-1 мл. Количество клеток в 1 мм средыа х 25 х 104. Поставленная задача решается тем, что для получения соматических гибридов картофеля сливают суспензионные и мезофильные протопласты растений,используя 40-ный полиэтиленгликоль (ПЭГ) и глицин-аОН-буфер,приготовленный на основе культурального фильтрата(КФ) микроводоросли хлореллы,содержащий биологически активные вещества. КФ используется в качестве раствора для выделения мезофильных протопластов, роста клеток и вместо солей ферментативного,промывающего,флотационного растворов и антиоксидантов. Хлорелла культивируется на минеральной среде Тамия Топачевский А.В.,Масюк Н.П.,Пресноводные водоросли Украинской ССР, Киев,Вища школа, 1984, с. 336. КФ отбирается из среды культивирования хлореллы,которая обогащается метаболитами жизнедеятельности хлореллы, фильтруется и хранится неограниченное время в холодильнике. Он содержит все вещества необходимые для роста клеток минеральные соли,витамины,аминокислоты,антиоксиданты и биологически активные вещества Музафаров .,Таубаев Т.Т. Культивирование и применение микроводорослей. Ташкент Фан, 1984, с. 134,Барашков Г.К. Химия водорослей. М.-Л. Изд-во АН СССР, 1963, с.238. Выделенные протопласты из суспензионной культуры плотностью 7-9105 прот/мл культурных форм растений и мезофильные протопласты диких форм плотностью 4-6105 прот/мл смешивают в питательной среде в соотношении 11. Пипеткой в чашки Петри наносят каплю смеси примерно на 1 см. Оставляют на время от 5 до 10 минут, затем отмывают от ПЭГ солевым раствором. Маркером отбора гибридных клеток является наличие в них хлоропластов, которые собираются вдоль ядра и цитоплазматических тяжей. При использовании растворов используемой методики (пример 1) выход мезофильных протопластов составляет 6,4-7,9103,при использовании раствора с антиоксидантами - 4,95,8105, с КФ в 1,8-2 раза больше - 8,1-9,0 х 105 клеток/мл. Пример 1 Сравнительный выход мезофильных протопластов растений в зависимости от применения различных растворов Ферментативный раствор/выход жизнеспособных протопластов, клеток/мл Растворы используемой методики Раствор с антиоксидантами КФ микроводоросли 6,4-7,9103 4,9-5,8105 8,1-9,0105 Смесь протопластов обрабатывали раствором 40-го ПЭГ для слияния, время инкубации 15-20 2 мин. После промывания в отмывочном растворе суспензию протопластов переносили в чашку Петри 22663 с модифицированной питательной средой В 5 для образования микроколоний,Пример 2 Количественный выход гибридных клеток картофеля при слиянии суспензионных и мезофильных протопластов Протопласты картофеля Исходные Гибриды Квадраты счетной камеры 4 5 6 7 8 4 3 7 5 3 2 Как видно из данных таблицы выход гибридных клеток при слиянии суспензионных и мезофильных Выход протопластов в 1 мл питательной среды 1,15106 7,5 х 104 протопластов картофеля составил 7,5104 кл/мл Пример 3 Количественный выход делящихся гибридных клеток картофеля Гибридные клетки Делящиеся клетки картофеля Квадраты счетной камеры 2 3 4 17 18 13 Количество делящихся гибридных клеток картофеля составило 23. Использование 40-ного ПЭГ,а также глицин-аОН-буфера,приготовленного на основе КФ микроводоросли хлореллы способствовало большему выходу соматических гибридных клеток растений и процессу их деления (27) (пример 4). Пример 4 Количественный выход гибридных клеток картофеля при использовании КФ микроводоросли хлореллы Слившиеся и делящиеся клетки картофеля Гибридные клетки Делящиеся клетки Квадраты счетной камеры 2 3 4 5 73 79 84 80 15 22 19 27 Таким образом, предложенный нами способ получения соматических гибридных клеток картофеля слиянием суспензионных и мезофильных протопластов с применением 40-ного полиэтиленгликоля (ПЭГ) и глицин-аОН-буфера,приготовленного на основе культурального фильтрата(КФ) микроводоросли хлореллы,обеспечивает высокий выход жизнеспособных гибридных клеток и их деление, что является важным фактором для получения соматических гибридных растений картофеля. Выход делящихся гибридных клеток,27,0 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения соматических гибридных клеток картофеля, включающий использование протопластов,отличающийся тем,что соматические гибриды получают слиянием суспензионных и мезофильных протопластов с применением 40-ного полиэтиленгликоля (ПЭГ) и глицинбуфера, приготовленного на основе культурального фильтрата (КФ) микроводоросли хлореллы, содержащего биологически активные вещества.