Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L.-Mab/7F10-продуцент моноклональных антител к Brucella abortus

(51) 12 5/00 (2006.01) 12 5/06 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ разработке методов диагностики бруцеллеза, а также в микробиологии для изучения таксономии микроорганизмов. Штамм гибридных культивируемых клеток продуцирующих моноклональные антитела к липополисахаридуполучали гибридизацией иммунных лимфоцитов мыши линии/ с клетками миеломной линии 638.653 по методу Келера и Мильитейна, (1976). Изучение иммунохимических свойств моноклональных антител проводили с использованием непрямого и сэндвич-вариантов иммуноферментного анализа. Штамм гибридных культивируемых клеток животных., - продуцирует однородный по составу гомогенные препараты моноклональных антител,которые высоко специфичны к липополисахариду(1204800). Титры моноклональных антител секретируемые штаммом гибридомы составляют по ИФА в культуральной жидкости 1128, в асцитной жидкости 1204800. Концентрация белка в культуре клеток составляет 125 мкг/мл, в асцитной жидкости- 8 мг/мл. Синтезируемые штаммом гибридомы моноклональные антитела относятся к классу ,подклассу 1. Константа связывания (аффинность) моноклональных антител составляет 1109 М-1.(72) Булашев Айтбай Кабыкешович Ескендирова Сауле Зиядиновна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ.-/710-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К(57) Штамм гибридных культивируемых клеток животных., - продуцент моноклональных антител к. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине при Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине при разработке методов диагностики бруцеллеза, а также в микробиологии для изучения таксономии микроорганизмов. Известно,что клеточная стенка микроорганизмов содержит детерминанты,характерные для определенного рода или вида бактерий, и обладает более высокой антигенной и протективной активностью по сравнению с цитоплазматическими компонентами. Исходя из этого положения, в гибридомной технологии возможность получения клонов гибридом,синтезирующих желаемый тип моноклональных антител(МКА) должна повышаться при использовании спеленоцитов мышей линии /,стимулированных более специфичными компонентами клеточной стенки бруцелл полисахаридами (липополисахарид, поли-Б антиген и т.д. ) или белками внешней мембраны. Известен штамм гибридомы БИМА,продуцирующий высокоактивные МКА против полисахаридного антигена бактерии рода(А.с. 1604848, СССР, МКИ 12 5/00. Булашев А.К. и соавт. 46450116/30-13. Опубл.Б.И., 1990, 41.). Авторами для получения МКА были использованы лимфоциты мышей, иммунизированных поли-Б антигеномВ 115. Однако антитела данной гибридомы оказались направлены против полисахаридной детерминанты общей для бруцелл и близкородственного микроорганизма - йерсиний,поскольку они в одинаковой степени связывались в иммуноферментном анализе с антигенами как(1204800-1-409600), так и 09 (1409600). Известен другой штамм гибридомы БАМА,также продуцирующий МКА против полисахаридного антигена бактерии рода(А.с. 1604849,СССР, МКИ 125/00. 1990,41.). Антитела штамма БАМА вступали в реакцию с цельными клетками трех основных видов бруцелл и не реагировали с аналогичным антигеном использованных грамотрицательных бактерии(675,1221, ). Однако титры антител асцитной жидкости БАМА против интактных клетокив иммуноферментном анализе были существенно ниже, чем БИМА (11600 и 1800 соответственно). МКА штамма БАМА также слабо связывались с корпускулярным антигеноми 09 (1200). Такая слабая активность БАМА обусловлена низкой константой связывания (аффинностью) МКА,которая является основным показателем их диагностической ценности. Вышеупомянутые МКА штаммов гибридом БИМА и БАМА определены как иммуноглобулиныподкласса 2 а, и были использованы авторами в сэндвич-варианте иммуноферментного анализа и реакции латекс - агглютинации для обнаружения бруцеллезных антигенов в патматериале. Задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток,2 продуцирующего моноклональные антитела к. Штамм получают следующим образом. Мышам линии В/ в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг антигена - липополисахарида 54, в 0,1 мл полного адьюванта Фрейнда. Смесь взбивают до образования творожистой массы. На 7, 11, 12,13-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг антигена в забуференном физиологическом растворе (ЗФР),7,2-7,4. Спустя 3 дня после последней иммунизации спленоциты мышей,которые дают более высокие титры антител по ИФА используют для гибридизации. Гибридизацию проводят добавлением 1-го мл раствора,содержащего 45 полиэтиленгликоля 4000 и 10 диметилсульфоксида и 45 -1640 к смеси состоящей из 4106 клеток -63.-8 5.6.3. и 20106 спленоцитов в течение 1 минуты. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля их высевают в ячейки 96 луночной панели. На следующий день в эти лунки вносят среду с гипоксантином, аминоптерином и тимидином (ГАТ). Через 10-14 дней после слияния в лунках, имеющих колонии клеток размером 2-3 мм,отбирают культуральную среду для определения продуктивности гибридных клеток. Тестирование проводят методом твердофазного ИФА с использованием липополисахарида бруцелл и кроличьих иммуноглобулинов к антителам мыши,меченых пероксидазой хрена. В течение 21 дня после слияния, клетки находятся в среде ГАТ. Затем постепенно клетки переводят на среду гипоксантинтимидин (ГТ) и полную среду -1640. Клоны клеток, продуцирующих моноклональные антитела,трижды клонируют методом лимитирующих разведений. После третьего клонирования 90 субклонов продуцируют антитела к тестируемому антигену. Штамм гибридных клеток продуцирует антитела в культуральную среду. Продуктивный клон гибридомы обозначают /710. Штамм гибридных клеток/710 депонирован и хранится в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан(010000, г. Астана, ул. Ч. Валиханова,43) под регистрационным номером - 0271 и характеризуется следующими свойствами. Морфологическая характеристика. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные свойства. Гибридные клетки выращивают в среде -1640, содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-20) 20 мл/л 200 мМ глютамина- 3,375 г/л 2- меркаптоэтанола - 3 мкл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия- 3,7 г/л. Клетки культивируют при 37 С в атмосфере 5 С 2. Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация 2105 клеток в 1 мл. Частота пассирования через 3-4 суток. При внутрибрюшинном введении сингенным мышам штамм гибридомы образует опухоль в асцитной форме на 14 - 16 день. Доза клеток при прививке 2105 клеток. За 14 дней до введения гибридомы мышам вводят внутрибрюшинно 2,6,10,14 тетраметилпентадекан в дозе 0,5 мл на голову. Штамм сохраняет способность продуцировать специфические моноклональные антитела в течение 4 пассажей на сингенных мышах (время наблюдения). Продуктивность штамма. На 5 день культивирования гибридомы, концентрация МКА достигает 125 мкг/мл в культуральной среде, а при прививке сингенным мышам (в асцитной жидкости)- 8 мг/мл. Титр МКА иммуноглобулинов в культуральной среде составляет 1128, а в асцитной жидкости 1204800. Характеристика полезного продукта. Синтезируемые штаммом гибридомы моноклональные антитела относятся к классу ,подклассу 1. Константа связывания(аффинность) моноклональных антител по отношению к антигену бруцелл составляет 1109 М-1. Методы оценки специфичности МКА непрямой и сэндвич варианты ИФА. Контаминация. Контаминантов в клетках включая, бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружено. Криоконсервация. К осадку гибридных клеток добавляют эмбриональную сыворотку коров, и затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10. Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимися крышками по 2105 клеток в объеме 1 мл. Ампулы помещают в коробку из пенопласта и оставляют на сутки при -70 С, а затем переносят в жидкий азот. Условия размораживания. Замороженную ампулу быстро помещают в водяную баню при 37 С. После размораживания суспензию клеток переносят в стерильную пробирку, содержащую 10 мл холодной бессывороточной среды -1640,отмывают один раз и засевают в ячейки 24 луночной планшеты с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 85. Штамм гибридных культивируемых клеток/710 используют следующим образом. Пример 1. Гибридные клетки высевают в пластиковые матрасы площадью 25 см 2 по 2105 клеток в 1 мл питательной среды и инкубируют 3 дня при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Суспензию клеток с культуральной средой собирают и центрифугируют 10 минут при 800 с целью отделения клеток от надосадочной жидкости,содержащей антитела. При культивировании гибридомы на сингенных мышах, иммуноглобулины из асцитной жидкости получают методом высаливания сульфатом аммония до 50 насыщения. Для этого в асцитную жидкость добавляют равный объем 0,15 М забуференного физиологического раствора (ЗФР), -7,2. Затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при перемешивании на ночь при 4 С. Иммуноглобулины отделяются центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 30 минут, при 4 С. Осадок антител ресуспендируют в минимальном объеме ЗФР. Пример 2. Для проведения непрямого ИФА в лунки 96-луночного планшета для иммунологических реакции вносят суспензию интактных клеток бруцелл в концентрации 110 кл/мл или липополисахариды бруцелл в концентрации 0,01 мг/мл, в 0,1 мл ЗФР,7,2-7,4 и выдерживают при -4 С в течение ночи. Планшет отмывают 3 раза ЗФР, содержащим 0,1 твина -20(ЗФР-Тв) и 3 раза ЗФР, и в каждую лунку вносят по 0,1 мл 1 раствора бычьего сывороточного альбумина на ЗФР-Тв для блокировки свободных поверхностей твердой фазы. Через 1 час после инкубации при 37 С содержимое лунок удаляют и планшет отмывают вышеописанным способом. В лунках двух вертикальных рядов планшета готовят двукратные разведения исследуемой культуральной жидкости (КЖ) (12 и более) и асцитной жидкости(1100 и более) в 0,1 мл ЗФР-Тв. Одновременно ставят контроли с культуральной жидкостью миеломных клеток в тех же разведениях и с ЗФРТв. Планшет инкубируют в термостате при 37 С в течение 1 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют, повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл рабочего разведения коньюгата антител кролика против иммуноглобулинов мышей, меченные пероксидазой хрена, в ЗФР-Тв. Через 1 час после инкубации при 37 С повторяют процедуру отмывки планшета с целью удаления несвязанных продуктов реакции. Наличие антител против антигена бруцелл определяют количественно по расщеплению субстрата в присутствии хромогена ортофенилендиамина. Результаты реакции учитывают на спектрофотометре путем измерения оптической плотности жидкости в каждой лунке при длине волны 492 нм. Положительная реакция характеризуется появлением в лунках темнокоричневого окрашивания, при отрицательной содержимое лунок остается бесцветным или имеет светло-желтое окрашивание. Титром моноклональных антител считают ее максимальное разведение, величина оптической плотности в котором в 2 и более раза превосходит и оптическую плотность в лунках с отрицательным контролем. Результаты опыта по определению специфичности МКА в непрямом варианте ИФА представлены в таблице 1. Таблица 1 Изучение специфичности и активности МКА штамма гибридомы /7 10 Виды антигенов Титры моноклональных антител в культуральной жидкости в асцитной жидкости Растворимые антигены 164 1102400 1128 1204800 14 11600 Цельные клетки 164 1128 12 РО РО РО РО Как видно из таблицы, титры МКА в асцитной жидкости к липополисахаридам (ЛПС)19 и 54 были достаточно высокими (1102400 и 1204800) и аналогичны титрам к интактным клеткам 19 и 54, что свидетельствует о иммунодоминантности выявляемого антигена на клеточной мембране. МКА гибридных клеток 710,имея высокую специфичность по отношению к ЛПС 19 и 54, существенно отличаются по сродству к ЛПС 16 М (11600). По результатам непрямого ИФА с использованием в качестве антигенов интактных клеток бруцелл МКА гибридомы 710 также оказались более специфичными к, нежели к. МКА данной гибридомы вступали в слабую перекрестную реакцию с йерсиниями серовара 09(1200). Пример 3. На 96-луночную планшету для иммунологических реакций сорбируют МКА из асцитной жидкости (20 мкг/мл) в 100 мкл бикарбонатного буфера ( 9,6) при 4 С в течение ночи. Затем планшет отмывают по три раза ЗФР-Тв и 3 раза ЗФР, вносят в ячейки полисахаридные антигены (ЛПС)ив концентрации 5 мкг/мл и инкубируют при 37 С в течение часа. Панель отмывают описанным способом, готовят в ячейках двукратные разведения позитивной бруцеллезной сыворотки крупного рогатого скота. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку этого же вида животного. После выдерживания панели при 37 С в течение 1,5 ч повторяют процедуру отмывки и в ячейки вносят коньюгат - кроличьи антитела противкрупного рогатого скота, меченые пероксидазой. Концентрацию связывающих антител определяют по примеру 2. Результаты исследовании приведены в таблице 2. Таблица 2 Специфичность связывания моноклональных антител штамма /7 10 св сэндвич варианте ИФА Антигены бруцелл Показатели экстинции в зависимости от степени разведения позитивной сыворотки крупного рогатого скота 1100 1200 1400 1800 11600 13200 16400 1,096 0,893 0,702 0,587 0,421 0,197 0,076 16 М Примечание показатель экстинции негативной сыворотки был равен 0,048. Приведенные данные свидетельствуют о возможности использования МКА штамма гибридных культивируемых клеток /710 в ИФА для серологического мониторинга крупного рогатого скота на бруцеллез. 4 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гибридных культивируемых клеток животных.-/710-продуцент моноклональных антител к,депонированный в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан МОН РК, под регистрационным номером С- 0271,используемый для разработки методов диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота.