Рекомбинантный штамм А/AstanaRG/5:3/2009 М-12-09/D вируса гриппа, применяемый в биотехнологии для производства диагностических и вакцинных препаратов против вируса Н5N1

(51) 12 7/00 (2010/01) 61 39/145 (2010/01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ представляет собой сконструированныйновый актуальный рекомбинантный штамм вируса гриппа. Инфекционная и гемагглютинирующая активность вируса на 10-11-суточных РКЭ составляет 8,45 ЭИД 50/см 3 и 9,0 2 соответственно. В тесте патогенности на 10 суточных куриных эмбрионах,42-суточных цыплятах, и 2-3 недельных белых лабораторных мышах было установлено, что рекомбинантный штамм//53/2009 вируса гриппа апатогенен для них, тогда как высокопатогенный штамм-донор///6/05 (51) приводит к их 100 гибели после инфицирования. В тесте бляшкообразования у рекомбинантного штамма//53/2009 установлено наличие трипсинозависимого фенотипа, характерного для низкопатогенных вирусов гриппа. Рекомбинантный штамм//53/2009 вируса гриппа в процессе пассирования (5 пассажей) на 10-11 -суточных РКЭ проявляет стабильные свойства. Установлено,что все серии рекомбинантного штамма //53/2009 вируса гриппа сохраняют свою исходную биологическую и гемагглютинирующую активность в течение 6 месяцев. Результаты секвенирования подтвердили,что последовательности генов гемагглютинина штамма//53/2009 вируса гриппа содержит модифицированный сайт расщепления гемагглютинина и сохраняет мутации,введенные для предотвращения возврата к дикому типу. Активность рекомбинантного штамма//53/2009 вируса гриппа в серологических реакциях составляет 14-18 в РДП,140-180 в РТГА и 1640 в ИФА.(72) Мамадалиев Сейдигапбар Мамадалиевич Кисилев Олег ИвановичСандыбаев Нурлан ТамамбаевичХайруллин Берик Мухитович Цыбалова Людмила МарковнаГрудинин Михаил ПавловичМамбеталиев Муратбай Кыдырбаев Жайлаубай КыдырбаевичТабынов Кайсар КазыбаевичСтрочков Виталий МихайловичТабынов Кайрат Казыбаевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ А//53/2009 М-12-09/ ВИРУСА ГРИППА,ПРИМЕНЯЕМЫЙ В БИОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ВИРУСА Н 51//53/2009 -13-09/ вируса гриппа,методом обратной генетики из штаммов родатипа А, наиболее близкого к репрезентативным штаммам клайда 2.2,рекомендованных ВОЗ для производства вакцин против гриппа /51. Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии, и Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии, и представляет собой сконструированныйновый актуальный рекомбинантный штамм вируса гриппа,используемый для производства диагностических и вакцинных препаратов против гриппа /51. Известен рекомбинантный штамм вируса гриппа-14 (,05/160) полученный методом обратной генетики из штаммов//1194/2004 (51) и //8/34 (11) используемый для производства вакцины против гриппа /51 М. ,.2007 1 5-9 Недостатком этого рекомбинантного штамма является входящий в его состав высокопатогенный штамм-донор //1194/2004 (51), который относится к 1 клайду вируса гриппа /51 по классификации ВОЗ являющиеся далеким от рекомендованных новых вакцинных штаммовкандидатов / //1 А/2005//244/05 полученных методом обратной генетики. Наиболее близким к заявляемому техническому решению (прототипом)является рекомбинантный штамм вируса гриппа А/курица/Курган/5/05 181/53 (51),,М.М., . .512005 // . . . 42 (1),70-78 (2008),полученный методом обратной генетики из штаммов А/курица/Курган/5/05 (51) и 116 (реассортант вирусов / /8/34 и/ /20/99), который относится к клайду 2.2 вируса гриппа /51 и по классификации ВОЗ близок к рекомендованным новым вакцинным кандидатам ////2005- , А /// 1/2005 - , / //244/05 полученных методом обратной генетики.). Недостатки этого штамма в цитируемой литературе не указываются. По сравнению с прототипом предлагаемый рекомбинантный штамм//53/2009 вируса гриппа отличается тем, что в его составе имеется высокорепродуктивный штамм-донор/20/99). Задачей настоящего изобретения являлось конструированиенового актуального рекомбинантного штамма вируса гриппа, наиболее близкого к репрезентативным штаммам клайда 2.2,рекомендованных ВОЗ для производства диагностических и вакцинных препаратов против вируса гриппа /51, обладающего низкой вирулентностью и высокой репродуктивной активностью в системе культивирования. Предлагаемое изобретение включает рекомбинантный штамм,совокупность 2 существенных признаков которого, обеспечивает получение следующих технических результатов. Рекомбинантный штамм //53/2009 вируса гриппа, получен методом обратной генетики из высокопатогенного штамма-донора/8/34 (11). Штамм-донор ///6/05 (51) был выделен в Акмолинской области Республики Казахстан в 2005 году и является высокопатогенным штаммом с антигенной формулой 51. Филогенетический анализ гемагглютинина показал его принадлежность к клайду 2.2, представители которого рекомендованы ВОЗ при отборе кандидатов для разработки препандемических вакцин против гриппа /51 (Приложение А). В связи с этим высокопатогенный штамм///6/05 (51) был выбран в качестве донора генов гемагглютинина (модификация сайта протеолитического расщепления), нейраминидазы и М-белка. Штамм-донор / /8/34 (11) вируса гриппа рекомендован ВОЗ для конструирования рекомбинантных штаммов гриппа методом обратной генетики, так как отличается высокими репродуктивными свойствами в системе культивирования (куриные эмбрионы). В связи с этим выбран в качестве донора внутренних белков РВ 2, РВ 1, ,и . Для конструирования рекомбинантного штамма//53/2009 вируса гриппа использованы 8 плазмид, каждая из которых содержала один из- пяти внутренних генов (РВ 2, РВ 1, ,и//53/2009 вируса гриппа состоит их следующих этапов (Приложение Б) 1. Амплификация полноразмерных сегментов НА,и М штамма ///6/05(5). Для получения полноразмерных сегментов гемагглютинина, нейраминидазы и М-гена были подобраны праймеры,позволяющие амплифицировать последовательности сегментов. Первоначально проводили наработку кДНК вируса гриппа с помощью универсального праймера 12. Состав реакционной смеси для наработки полных сегментов НА,и М был следующий Вода-2 мкл Общий объем реакционной смеси составлял 50 мкл. Температурно-временной режим амплификации 94 С 4 мин 94 С 20 сек 56 С 30 сек 30 циклов 72 С 4 мин 72 С 7 мин Анализ продуктов амплификации проводили в 1 агарозном геле на буфере ТВЕ. Так как штамм ///6/05 (51) является высокопатогенным и имеет сайт протеолитического расщепления гемагглютинина с мотивом повторяющихся аминокислот,то необходимо было внести мутации в этот участок путем удаления этого мотива . Кроме того,для предотвращения возможности восстановления мотива повторяющихся основных аминокислот за счет соскальзывания полимеразы, были введены замены Т и КТ (Приложение В). В результате, мотив повторяющихся основных аминокислот высокопатогенного штамма///6/05 (51) был заменен на последовательность /, которая характерна для низкопатогенных штаммов Н 5 вируса гриппа. 2. Клонирование НА, , РВ 1, РВ 2, , , М ив плазмиду 2000 Полноразмерные последовательности сегментов НА, , М от штамма ///6/05(5) и сегменты от штамма / /8/34 (11) РВ 1, 2, , ,были клонированы в двунаправленную экспрессионную плазмиду 2000. Для клонирования использовали ПЦР-продукты наработанные с помощью праймеров, имеющих на своем 5-конце сайт для расщепления рестриктазой. Для клонирования плазмиду 2000 и ПЦР-продукты разрезали данной рестриктазой с целью получения липких концов. Лигирование проводили с использованием набора, , по инструкции изготовителя. 3. Наработка плазмид Смесью лигированных плазмид трансформировали компетентные клеткис использованием методики -,который проводили при 42 С в течение 45 сек. Полученную смесь трансформированных клеток высевали на чашки Петри со средой гмампициллин,. Инкубировали в течение ночи при температуре 36 С. Отбор трансформантов проводили по методу бело-синих колоний. Отбирали отдельные колонии и пересевали на жидкую среду с ампициллином. Трансформированные бактерии выращивали в течение ночи в небольшом объеме жидкой питательной среды. Во всех случаях бактериальная ростовая среда состояла из питательного бульонас ампициллином. Плазмидную ДНК выделяли с использованием набора. 4. Трансфекция клеток 2000 является двунаправленной экспрессионной плазмидой и не требует дополнительных экспрессионных плазмид. Для получения рекомбинантного штамма(Европейская коллекция клеточных культур 4 0, Великобритания, 134 пассаж, среда /12 с добавлением 10 фетальной бычьей сыворотки и 2 М -) с использованием 2000. Для трансфекции готовили смесь плазмид,которая содержит по 1 мкг каждой плазмиды со вставками (всего 8 плазмид) и добавляем среду МЕМ до конечного объема 50 мкл для каждой ДНК трансфекции. Далее готовили мастер-микс смесь 2000. Для этого в конической 50 мл пробирке смешиваем 250 мкл среды - с 12 мкл 2000, осторожно перемешиваем пипетированием и инкубируем при комнатной температуре в течение 10 мин. К каждому образцу ДНК для трансфекции добавляли по 262 мкл смеси-,перемешивали пипетированием и оставляли при комнатной температуре на 30 мин. Трансфецированные клетки сеяли в 6-луночные планшеты. В каждую ячейку планшета добавляли по 1,25 мл ресуспендированной культуры клетоки вносили смесь ДНК с 2000 (около 320 мкл). Планшеты инкубировали в течение 8-12 часов при температуре 37 С. Через 16 часов осторожно убирали среду из каждой лунки планшета и к каждой лунке добавляли по 1,5 мл средыи по 1,5 мкл трипсина (1 мг/мл). Через 2 дня после развития цитопатического эффекта собирали супернатант и использовали его для проведения теста бляшкообразования и для заражения куриных эмбрионов. В тесте бляшкообразования рекомбинантный штамм//53/2009 вируса гриппа продуцировал бляшки на клеткахтолько в присутствии трипсина. Результаты данного теста подтвердили наличие трипсинозависимого фенотипа, характерного для низкопатогенных вирусов гриппа. 5. Наработка рекомбинантного штамма в развивающихся куриных эмбрионах Культуральным вариантом полученного рекомбинантного штамма //53/2009 вируса гриппа заражали куриные эмбрионы при температуре инкубирования(330,5)С. Восстановленный двумя пассажами на развивающихся куриных-эмбрионах вирус обозначен как рекомбинантный штамм//53/2009 вируса гриппа. 6. Секвенирование генов рекомбинантного штамма //53/2009 С целью определения соответствия нуклеотидного состава сегментов рекомбинантного штамма к исходному, было проведено секвенирование генов НА,и М-гена рекомбинантного штамма//53/2009 вируса гриппа. В результате секвенирования и анализа нуклеотидных последовательностей было показано,что сегментыи М полностью соответствует 3 последовательности дикого типа штамма///6/05(51). Сегмент НА имеет последовательность,совпадающую с последовательностью модифицированного сегмента. Для подтверждения стабильности модифицированной последовательности гена НА было проведено 5 дополнительных пассажей рекомбинантного штамма //53/2009 вируса гриппа на куриных эмбрионах. Секвенирование последовательности гена,кодирующего НА подтвердили наличие модификации в сайте расщепления гена гемагглютинина (Приложение Г). Проведенные исследования показали, что рекомбинантный штамм//53/2009 вируса гриппа в процессе пассирования (5 пассажей) на куриных эмбрионах проявляет стабильные свойства. Как видно из данных, представленных в приложении Г, нуклеотидные последовательности модифицированного участка гена гемагглютинина,как у исходного рекомбинантного штамма, так и у штамма,прошедшего различные пассажи полностью идентичны. В приложении Г также показано наличие последовательности основных аминокислот в сайте разрезания гемагглютинина у дикого штамма ///6/05(5), в то же время отсутствующего у рекомбинантного штамма. 7. Паспортизация рекомбинантного штамма//53/2009 вируса гриппа 7.1 Проверка безвредности рекомбинантного штамма //53/2009 Безвредность полученного рекомбинантного штамма //53/2009 вируса гриппа было подтверждено в следующих лабораторных тестах интравенозный индекс патогенности на цыплятах, в тесте патогенности для белых лабораторных мышей и куриных эмбрионов. Интравенозный индекс патогенности вируса//53/2009 на 42-суточных цыплятах составил 0,00. Штамм отнесен к низкопатогенному варианту вируса гриппа, так как его ИВИП составляет 1,2. В тесте патогенности на 2-3 недельных белых мышах было установлено, что рекомбинантный штамм//53/2009 вируса гриппа апатогенен для белых мышей по сравнению с исходным диким штаммом ///06/05(51). В тесте патогенности на куриных эмбрионах было показано, что рекомбинантный штамм//53/2009 вируса гриппа способен расти до высоких титров, не вызывая гибели куриных эмбрионов. 7.2 Антигенный анализ рекомбинантного штамма Антигенное анализ рекомбинантного штамма///6/05 (51) подтверждено в РТГА. В результате постановки РТГА установлено, что рекомбинантный штамм//53/2009 соответствует по антигенной структуре дикого штамма ///6/05 (51). 4 7.3 Определение биологической активности рекомбинантного штамма Биологическая активность наработанного рекомбинантного штамма//53/2009 после лиофилизации с 6,5 пептоном в конечной концентрации составила 8,45 ЭИД 50/см 3 с гемагглютинирующей активностью 1512. 7.4 Стерильность рекомбинантного штамма Тесты на бактериальную и грибковую контаминацию показали стерильность рекомбинантного штамма //53/2009 вируса гриппа в отношении бактериальных и грибковых микроорганизмов. В результате проведенного скрининга посевного штамма//53/2009, наличие плазмидной ДНК не обнаружена. 7.5 Стабильность сохранения основных биологических свойств рекомбинантного штамма Проверяли стабильность сохранения основных биологических свойств 3-х серий рекомбинантного штамма //53/2009 вируса гриппа при долгосрочном хранении. С этой целью ежемесячно в течение 6 месяцев проверяли биологическую активность и гемагглютинирующий титр вируса,хранящего при температуре минус 20 С. Установлено, что все серии рекомбинантного штамма //53/2009 вируса гриппа сохраняют свою исходную биологическую и гемагглютинирующую активность. Полученный рекомбинантный штамм//53/2009 вируса гриппа депонирован в Коллекции микроорганизмов Республиканского государственного предприятия Научноисследовательского института проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан (РГП НИИПББ КН МОН РК) с регистрационным номером -13-09/ и хранится в лиофилизированном виде с защитной средой - 6,5 пептон в соотношении 11 (рН 7,2-7,6), при минус 40-70 С в ампулах ШПБ-6 под вакуумом. Жизнеспособность рекомбинантного штамма в стабильном состоянии поддерживается путем ежегодного освежения на 10-11 -суточных развивающихся куриных эмбрионах. Активность рекомбинантного штамма //53/2009 вируса гриппа в серологических реакциях составляет 14-18 в РДП, 140-180 в РТГА, 1640 в ИФА. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Рекомбинантный штамм А//53/2009 вируса гриппа, полученный методом обратной генетики из высокопатогенного штамма-донора/8/34 (11), депонированный в Коллекции микроорганизмов РГП НИИПББ КН МОН РК, под номером М-12-09/, применяемый в биотехнологии для производства диагностических и вакцинных препаратов против вируса гриппа 51.